【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总的来说涉及核酸检测领域。特别地，本说明书教导了一种检测样品中多核苷酸分析物的方法。
技术介绍
1、核酸的体外扩增和检测具有多种临床应用，尤其是在诊断急性和慢性病症(包括由传染病引起的那些)方面。定量聚合酶链反应(qpcr)和直接测序是可靠的核酸检测方法，但这些技术需要精密的仪器，并且成本高昂且耗时。新一代检测测定法(包括入侵测定(invader assay)和基于crispr的方法)力求兼具易用性和成本效益，同时不影响测定特异性和灵敏度。
2、入侵测定是一种检测和定量分析dna或rna的方法。它不会扩增目标靶标，而是仅在存在正确靶标序列的情况下生成和扩增无关信号。该测定涉及以靶标依赖的方式生成入侵性切割结构，使得结构特异性酶切割入侵性切割结构以释放可以进一步检测的信号。该测定涉及使用两种引物，即，入侵引物和瓣(flap)引物。瓣引物具有与靶标互补的3’部分和通常与靶标序列无关的5’部分。不与靶标杂交的瓣引物的5’部分形成5’瓣。入侵引物退火到与靶标退火的瓣引物的5’部分的靶标5’，瓣引物和入侵引物重叠，形成分叉重叠结构，该结构被认为类似于链置换dna合成过程中产生的结构。入侵引物和瓣引物通常重叠一个核苷酸，但也可以使用更长的重叠。分叉结构被切割以释放5’引物的5’瓣，然后释放的5’瓣用作可检测的信号。入侵测定的缺点包括检测速度慢、需要初始变性步骤以及需要荧光检测系统。
3、基于crispr的方法包括detectr和sherlock测定。detectr测定依赖于cas12核酸酶来检测dna靶标，
4、希望能够克服或改善上述问题中的至少一个，或者至少提供一种有用的替代方案。
技术实现思路
1、本文公开了一种检测样品中的多核苷酸分析物的方法，所述方法包括：a)使包含多核苷酸分析物的样品接触：i)第一核酸探针，所述第一核酸探针包含与多核苷酸分析物的第一部分互补的3’部分和不与多核苷酸分析物互补且不与多核苷酸分析物杂交的5’部分；ii)第二核酸探针，所述第二核酸探针包含与所述多核苷酸分析物的第二部分互补的5’部分和不与多核苷酸分析物互补且不与多核苷酸分析物杂交的3’部分，其中所述多核苷酸分析物的第一部分与多核苷酸分析物的第二部分在5’相邻；和iii)结构特异性核酸切割剂；其中第一核酸探针与多核苷酸分析物的第一部分的杂交以及第二核酸探针与多核苷酸分析物的第二部分的杂交形成切割结构；其中，切割结构的形成使得切割剂切割第一核酸探针以释放5’瓣，所述5’瓣包含不与多核苷酸分析物互补也不与多核苷酸分析物杂交的第一核酸探针的5’部分；b)将5’瓣连接至核酸衔接子以形成衔接子连接产物，其中核酸衔接子包含双链区和与5’瓣互补的3’突出延伸(overhang extension)，其中3’突出延伸与5’瓣杂交；c)使衔接子连接产物接触：i)v型crispr/cas效应蛋白；ii)指导rna，所述指导rna包含结合至v型crispr/cas效应蛋白的区域和指导序列，所述指导序列是与5’瓣的部分以及连接至并邻近5’瓣的核酸衔接子的部分互补；和iii)单链检测dna；和d)测量由v型crispr/cas效应蛋白切割单链检测dna产生的可检测信号以检测衔接子连接产物，从而检测样品中的多核苷酸分析物。
2、本文公开了一种检测样品中的多核苷酸分析物的单核苷酸多态性(snp)的方法，所述方法包括：a)使包含多核苷酸分析物的样品接触：i)第一核酸探针，所述第一核酸探针包含与多核苷酸分析物的第一部分互补的3’部分和不与多核苷酸分析物互补且不与多核苷酸分析物杂交的5’部分；ii)第二核酸探针，所述第二核酸探针包含与所述多核苷酸分析物的第二部分互补的5’部分和不与多核苷酸分析物互补且不与多核苷酸分析物杂交的3’部分，其中所述多核苷酸分析物的第一部分与多核苷酸分析物的第二部分在5’相邻；和iii)结构特异性核酸切割剂；其中第一核酸探针与多核苷酸分析物的第一部分的杂交以及第二核酸探针与多核苷酸分析物的第二部分的杂交形成切割结构；其中，切割结构的形成使得切割剂切割第一核酸探针以释放5’瓣，所述5’瓣包含不与多核苷酸分析物互补也不与多核苷酸分析物杂交的第一核酸探针的5’部分；b)将5’瓣连接至核酸衔接子以形成衔接子连接产物，其中核酸衔接子包含双链区和与5’瓣互补的3’突出延伸，其中3’突出延伸与5’瓣杂交；c)使衔接子连接产物接触：i)v型crispr/cas效应蛋白；ii)指导rna，所述指导rna包含结合至v型crispr/cas效应蛋白的区域和与5’瓣的部分以及连接至并邻近5’瓣的核酸衔接子的部分互补的指导序列；和iii)单链检测dna；和d)测量由v型crispr/cas效应蛋白切割单链检测dna产生的可检测信号以检测衔接子连接产物，从而检测样品中的多核苷酸分析物的snp。
3、本文公开了一种检测样品中的多核苷酸分析物的方法，所述方法包括
4、a)i)使包含多核苷酸分析物的样品接触第一核酸探针和第二核酸探针，所述第一核酸探针和第二核酸探针被配置为在多核苷酸分析物的存在下形成切割结构；和
5、ii)结构特异性核酸切割剂；
6、其中切割结构的形成使得切割剂切割第一核酸探针以从第一核酸探针释放5’瓣；
7、b)将5’瓣连接到核酸衔接子以形成衔接子连接产物，其中核酸衔接子包含双链区域和与5’瓣互补的3’突出延伸，并且其中3’突出延伸与5’瓣杂交；
8、c)使衔接子连接产物接触：
9、i)v型crispr/cas效应蛋白；
10、ii)指导rna，所述指导rna包含与v型crispr/cas效应蛋白结合的区域和与5’瓣的部分以及连接至并邻近5’瓣的核酸衔接子的部分互补的指导序列；和
11、iii)单链检测dna；和
12、d)测量由v型crispr/cas效应蛋白切割单链检测dna产生的可检测信号以检测衔接子连接产物，从而检测样品中的多核苷酸分析物。
13、本文公开了一种用于检测样品中的多核苷酸分析物的试剂盒，其包含结构特异性核酸切割剂、核酸连接酶和v型crispr/cas效应蛋白。
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1.一种检测样品中的多核苷酸分析物的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸分析物为DNA或RNA。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多核苷酸分析物为单链的或双链的。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在步骤(a)之前扩增所述多核苷酸分析物。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸分析物包含单核苷酸多态性(SNP)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸分析物为病毒核酸。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中步骤a)的切割剂为具有瓣内切酶活性的酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述具有瓣内切酶活性的酶为来自嗜热栖热菌Thermus thermophilus的DNA聚合酶。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述具有瓣内切酶活性的酶包含与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
10.根据权利要求1至9中任一项
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述连接酶为热稳定的连接酶。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述V型CRISPR/Cas效应蛋白为Cas12蛋白。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中单链检测DNA包含荧光团-猝灭剂对。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中通过视觉检测单链检测DNA的切割。
15.一种检测样品中的多核苷酸分析物的单核苷酸多态性(SNP)的方法，所述方法包括：
16.一种检测样品中的多核苷酸分析物的方法，其包括
17.一种用于检测样品中的多核苷酸分析物的试剂盒，其包含结构特异性核酸切割剂、核酸连接酶和V型CRISPR/Cas效应蛋白。
18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述结构特异性核酸切割剂为多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
19.根据权利要求17或18所述的试剂盒，其进一步包含第一核酸探针和第二核酸探针，其中所述第一核酸探针和第二核酸探针被配置为在所述多核苷酸分析物的存在下形成切割结构。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的试剂盒，其进一步包含第一衔接子多核苷酸和第二衔接子多核苷酸，其中第一衔接子多核苷酸和第二衔接子多核苷酸被配置成在杂交时形成核酸衔接子。
21.根据权利要求20所述的试剂盒，其进一步包含指导RNA和连接产物，所述指导RNA被配置成与V型CRISPR/Cas效应蛋白结合以及所述连接产物是核酸衔接子和结构特异性核酸切割剂的切割产物。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的试剂盒，其进一步包含单链检测DNA。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种检测样品中的多核苷酸分析物的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸分析物为dna或rna。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多核苷酸分析物为单链的或双链的。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在步骤(a)之前扩增所述多核苷酸分析物。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸分析物包含单核苷酸多态性(snp)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸分析物为病毒核酸。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中步骤a)的切割剂为具有瓣内切酶活性的酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述具有瓣内切酶活性的酶为来自嗜热栖热菌thermus thermophilus的dna聚合酶。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述具有瓣内切酶活性的酶包含与seq id no:1中所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中步骤c)在连接酶的存在下进行。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述连接酶为热稳定的连接酶。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述v型crispr/cas效应蛋白为cas12蛋白。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：张旭，尼基尔·阿加瓦尔，黄仁暎，凌华，符儒伦，
申请(专利权)人：新加坡国立大学，
类型：发明
国别省市：
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