【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞生物学，具体涉及一种b群脑膜炎球菌外膜囊泡蛋白制备方法。
技术介绍
1、脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitidis，nm)，俗称脑膜炎球菌(meningococcus)，是一种致病性革兰氏阴性双球菌。菌体呈现肾型或豆型，菌体直径0.6μm～0.8μm,无芽孢，无鞭毛。
2、流行的菌群主要有a、b、c和w135群，a群流脑病例构成总体呈减少趋势，b群和w135群呈上升趋势。全球上市的流脑疫苗主要有a群、a+c群以及a、c、w135及y群的四价疫苗等，这些疫苗的有效免疫原成分均为脑膜炎球菌的荚膜多糖。然而，b群脑膜炎球菌荚膜多糖与人n-乙酰神经氨酸聚合物结构相似，可能会引起严重的自身免疫反应，且b群脑膜炎球菌荚膜多糖免疫原性低，难以在儿童中引起有效免疫保护作用，因此不适合用作疫苗候选抗原。
3、已上市的b群脑膜炎球菌疫苗主要有两种，一种是以外膜蛋白(omp)为主要成分的外膜囊泡(omv)疫苗；另一种是基于反向疫苗学技术的重组蛋白疫苗。
4、omv是革兰氏阴性菌表面分泌的产物，是细菌外膜在一定的机制下发生出芽并在细菌表面形成一种囊泡状的结构。外膜囊泡大多数为球形，直径大约在20～250nm之间，其组成成分包括脂多糖、外膜蛋白、磷脂、dna以及在形成过程中被外膜包裹的周质成分等。
5、传统上采用去污剂edta提取的方法制备b群脑膜炎球菌外膜囊泡，即在乙二胺四乙酸(edta)存在下使用脱氧胆酸钠进行抽提、获得omv(domv)。脑膜炎球菌的脂多糖(lps)是
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种b群脑膜炎球菌外膜囊泡蛋白制备方法，避免传统工艺采用去污剂edta带来的免疫原性蛋白损失以及造成的工艺成本高的技术问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了以下技术方案：
3、本专利技术提供的一种b群脑膜炎球菌外膜囊泡蛋白制备方法，包括以下步骤：
4、(1)b群脑膜炎球菌细菌复苏；
5、(2)将复苏后的菌种转种至装有流脑半综合液体的培养装置进行菌种扩增培养；
6、(3)扩增完成的菌种转种至发酵罐，开启通气和搅拌进行发酵，于细菌对数生长期的末期或静止期的前期，终止培养；
7、(4)b群脑膜炎球菌外膜囊泡蛋白的收集
8、菌体与提取缓冲液按照1:10-20g/ml的比例搅拌混匀，进行恒温振荡，然后离心分离收集上清液，上清液加入等体积氯化钠溶液，洗滤两次；
9、(5)b群脑膜炎球菌外膜囊泡蛋白的纯化
10、在洗滤后的上清液中加入聚氧乙烯单叔辛基苯基醚至终浓度1％，混匀后离心静置吸取上层液体，用30kd超滤膜包、以20mm pb为超滤溶液超滤三次进行换液；
11、将超滤后溶液上样于预先用a液平衡好的sepharose q ff层析柱，上样完成后b液进行洗脱，收集洗脱峰；
12、将收集的溶液上样于预先用b液平衡好的羟基磷灰石层析柱，上样完成后c液进行洗脱，收集流穿峰，除菌过滤后保存。
13、进一步的，所述(1)中复苏的方法包括：取b群脑膜炎球菌440910型工作种子一支，接种至装有流脑半综合液体培养基的细胞培养瓶中，放置于二氧化碳细胞培养箱，于35～38℃培养18～26小时。
14、进一步的，所述(2)中扩增培养条件为：恒温振荡培养箱，150～250rpm转速下于35～38℃培养3～5小时。
15、进一步的，所述(3)中发酵条件为通气量为10～100l/min，搅拌转速为100～500rpm，温度在35～38℃，培养6～8小时。
16、进一步的，所述(4)中提取缓冲液为0.2mol/l氯化锂+0.1mol/l醋酸钠溶液；所述恒温振荡条件：温度45℃～55℃，转速150转/分，振荡1～2小时；所述离心条件转速11000rpm，温度2～8℃，离心1小时；收集上清液时采用0.45μm滤器澄清过滤。
17、进一步的，所述(5)中a液为20mm pb，ph7.0溶液；所述b液为20mm pb，0.45mnacl，ph7.0溶液；所述c液为500mm pb，0.45m nacl，ph7.0溶液。
18、进一步的，所述(5)中加入聚氧乙烯单叔辛基苯基醚至终浓度1％后置于2-8℃冷库振荡混匀后放置60min，然后在15000g离心力下室温离心15min静置。
19、基于上述技术方案，本专利技术实施例至少可以产生如下技术效果：
20、(1)本专利技术提供的b群脑膜炎球菌外膜囊泡蛋白制备方法，采用独有的omv溶出技术，不使用edta，能够很好地溶出有效抗原蛋白成分，既减少了细菌胞内核酸等杂质成分溶出，减轻下游纯化工艺的压力，同时还能够保留外膜囊泡结构的完整性，有效保存了其免疫原性。
21、(2)本专利技术提供的b群脑膜炎球菌外膜囊泡蛋白制备方法，不采用去污剂edta提取，能够有效去除核酸、lps等杂质，能够减少接种发热反应，提高了疫苗的安全性。
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1.一种B群脑膜炎球菌外膜囊泡蛋白制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的B群脑膜炎球菌外膜囊泡蛋白制备方法，其特征在于，所述（1）中复苏的方法包括：取B群脑膜炎球菌440910型工作种子一支，接种至装有流脑半综合液体培养基的细胞培养瓶中，放置于二氧化碳细胞培养箱，于35～38℃培养18～26小时。
3.根据权利要求1所述的B群脑膜炎球菌外膜囊泡蛋白制备方法，其特征在于，所述（2）中扩增培养条件为：恒温振荡培养箱，150～250rpm转速下于35～38℃培养3～5小时。
4.根据权利要求1所述的B群脑膜炎球菌外膜囊泡蛋白制备方法，其特征在于，所述（3）中发酵条件为通气量为10～100L/min，搅拌转速为100～500rpm，温度在35～38℃，培养6～8小时。
5.根据权利要求1所述的B群脑膜炎球菌外膜囊泡蛋白制备方法，其特征在于，所述（4）中提取缓冲液为0.2mol/L氯化锂+0.1mol/L醋酸钠溶液；所述恒温振荡条件：温度45℃～55℃，转速150转/分，振荡1～2小时；所述离心条件转速11000rpm
6.根据权利要求1所述的B群脑膜炎球菌外膜囊泡蛋白制备方法，其特征在于，所述（5）中A液为20mM PB，pH7.0溶液；所述B液为20mM PB，0.45M NaCl，pH7.0溶液；所述C液为500mMPB，0.45M NaCl，pH7.0溶液。
7.根据权利要求1所述的B群脑膜炎球菌外膜囊泡蛋白制备方法，其特征在于，所述（5）中加入聚氧乙烯单叔辛基苯基醚至终浓度1%后置于2-8℃冷库振荡混匀后放置60min，然后在15000g离心力下室温离心15min静置。
...【技术特征摘要】
1.一种b群脑膜炎球菌外膜囊泡蛋白制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的b群脑膜炎球菌外膜囊泡蛋白制备方法，其特征在于，所述（1）中复苏的方法包括：取b群脑膜炎球菌440910型工作种子一支，接种至装有流脑半综合液体培养基的细胞培养瓶中，放置于二氧化碳细胞培养箱，于35～38℃培养18～26小时。
3.根据权利要求1所述的b群脑膜炎球菌外膜囊泡蛋白制备方法，其特征在于，所述（2）中扩增培养条件为：恒温振荡培养箱，150～250rpm转速下于35～38℃培养3～5小时。
4.根据权利要求1所述的b群脑膜炎球菌外膜囊泡蛋白制备方法，其特征在于，所述（3）中发酵条件为通气量为10～100l/min，搅拌转速为100～500rpm，温度在35～38℃，培养6～8小时。
5.根据权利要求1所述的b群脑膜炎球菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴强，黄义帆，李艳，唐雨琴，董重，陶杨，王文，樊钒，秦星瑶，陈飞，游正梅，
申请(专利权)人：成都欧林生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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