【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于药物纯化，涉及一种mrna快速纯化方法及其应用。
技术介绍
1、mrna作为疫苗具有高效、安全、生产质量可控等传统灭活病毒疫苗无法比拟的天然优势，但是mrna生产制造过程，特别是纯化环节挑战比较大。治疗性的mrna大多是通过体外反应ivt方法制备，该方法制备的mrna含有多种杂质。其中包括4种常规碱基底物，线性化模板dna，大肠杆菌hcp/hcd，聚合酶，生产聚合酶的宿主细胞蛋白，酶保护剂bsa，不完整的mrna片段，双链rna(dsrna)等。目前较多的方法是沉淀法(氯化锂，乙醇等)，层析法(亲和、离子、疏水、超滤、cht、core700等)。但是层析法对于较大的聚集体或者较小片段有些效果，但对于尺寸相当的一些杂质束手无策，同时该方法产业化放大较为困难，超滤法耗时久，操作复杂，捕获率低。
2、综上所述，亟需提供一种快速提纯、回收率高且及通量高的mrna快速纯化方法。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种mrna快速纯化方法及其应用，采用静态吸附模式，可以快速捕获ivt反应后的mrna分子，可以高效去除ivt反应底物及反应过程中的聚合酶及保护剂，蛋白去除可达2个log值，操作简单，成本低廉，适合小试及工业化放大，且回收率高于层析等方法。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了一种mrna快速纯化方法，所述方法包括：
4、将聚合物微球、高盐溶液、
5、本专利技术的采用聚甲基丙烯酸酯微球吸附洗脱的静态方式纯化mrna，仅需一步纯化即可在短时间内将mrna从反应液中快速分离，能够有效去除底物及相关聚合酶等成分，回收率可达90％以上，过程使用的溶剂安全，无毒性，适用于药物纯化及生产过程，相较于柱层析实验，其纯化更加灵活且步骤简单。该方法快速，高效率，获得较高纯度的mrna，解决了常规亲和层析成本太高，工艺时间较长的问题。
6、本专利技术中unicore10cm微球为无孔10微米粒径单分散的聚苯乙烯微球，表面键合羧基官能团，该微球填料机械强度好，化学稳定性高，耐酸碱及基本化学溶剂，可以用于静态吸附方式富集核酸特别是mrna，可一步静态结合实现mrna快速捕获，蛋白去除接近99％，且回收率大于90％。
7、unicore10cm微球的吸附原理是通过peg与氯化钠浓度合适比例关系，加之二价金属离子形成的阳离子桥的作用使得mrna与微球coo-官能团相互作用，进而产生吸附效果。
8、氯化钠与peg作为离液试剂，在吸附过程中可以促使mrna沉淀或者吸附于微球表面，其原理表现为夺水效应与包裹分子减少分子带电表面暴露，容易造成mrna分子间结合并且析出。
9、1000nt mrna测试依赖于一定浓度氯化钠与peg，且都为正相关。当nacl的浓度为0.5m，且peg4000的浓度低于10％时，mrna结合效率不高；提高nacl浓度或peg4000的浓度都会提高mrna结合效率。提高nacl的浓度不少于0.5m且peg4000浓度大于10％，mrna结合效率大于60％；nacl的浓度2m且peg4000浓度至10％时，mrna结合效率大于80％；单独提升peg4000浓度至15％mrna结合效率也可以大于80％。
10、优选地，所述mrna的来源包括mrna的体外转录合成反应液或沉淀后的mrna粗体物溶解液。
11、优选地，所述聚合物微球包括聚甲基丙烯酸酯微球聚苯乙烯微球、聚苯乙烯二乙烯基苯微球或聚丙烯酸酯微球中的任意一种或至少两种的组合。
12、优选地，所述聚合物微球的表面修饰有羧基和/或磺丙基。
13、优选地，所述聚合物微球包括unicore10cm。
14、优选地，所述mrna的体外转录合成反应液中含有核苷酸底物、模板、金属离子、聚合酶或蛋白保护剂中任意一种或至少两种的组合。
15、优选地，所述缓冲溶液包括tris-hcl。
16、优选地，所述有机溶剂包括聚乙二醇。
17、优选地，所述高盐溶液包括氯化钠溶液、氯化钾溶液、氯化锂溶液、硫酸钠溶液或硫酸钾溶液中的任意一种或至少两种的组合。
18、优选地，所述高盐溶液的浓度为0.5-2.5m。
19、上述0.5-2.5m中的点值具体可以选择0.5m、0.6m、0.8m、1.0m、1.2m、1.4m、1.6m、1.8m、2.0m、2.2m、2.5m等。
20、优选地，所述缓冲溶液包括tris-hcl。
21、优选地，所述tris-hcl的浓度为15-25mm。
22、上述15-25mm中的点值具体可以选择15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm、21mm、22mm、23mm、24mm、2.5mm等。
23、优选地，所述tris-hcl的ph为6.5-7.5。
24、上述6.5-7.5中的点值具体可以选择6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5等。
25、优选地，所述缓冲溶液还包括2价金属离子。
26、优选地，所述2价金属离子包括mg2+和/或ca2+。
27、优选地，所述所述缓冲溶液中2价金属离子的浓度为20-40mm。
28、上述20-40mm中的点值具体可以选择20mm、22mm、24mm、26mm、28mm、30mm、32mm、34mm、36mm、38mm、40mm等。
29、优选地，所述方法还包括淋洗。
30、优选地，所述淋洗使用的溶液包括乙醇溶液。
31、优选地，所述乙醇溶液的体积百分比为40％-60％。
32、上述40％-60％中的点值具体可以选择40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％等。
33、优选地，所述方法还包括洗脱。
34、优选地，所述洗脱使用的溶液包括tris-hcl和/或edta。
35、优选地，所述洗脱使用的溶液的ph为6-8。
36、上述6-8中的点值具体可以选择6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7、7.2、7.4、7.6、7.8、8等。
37、优选地，所述洗脱使用的溶液中tris-hcl的浓度为15-25mm。
38、上述15-25mm中的点值具体可以选择15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm、21mm、22mm、23mm、24mm、2.5mm等。
39、优选地，所述洗脱使用的溶液中edta的浓度为3-10mm。
40、上述3-10mm中的点值具体可以选择3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm等。
41、第二本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种mRNA快速纯化方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述mRNA的来源包括mRNA的体外转录合成反应液或沉淀后的mRNA粗体物溶解液；
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述mRNA的体外转录合成反应液中含有核苷酸底物、模板、金属离子、聚合酶或蛋白保护剂中任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂包括聚乙二醇。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述高盐溶液包括氯化钠溶液、氯化钾溶液、氯化锂溶液、硫酸钠溶液或硫酸钾溶液中的任意一种或至少两种的组合；
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液包括Tris-HCl；
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液还包括2价金属离子；
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括淋洗；
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括洗脱；
10.权利要求1-9中任一项所述的mRNA快速纯化方法在分离提纯mRNA中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种mrna快速纯化方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述mrna的来源包括mrna的体外转录合成反应液或沉淀后的mrna粗体物溶解液；
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述mrna的体外转录合成反应液中含有核苷酸底物、模板、金属离子、聚合酶或蛋白保护剂中任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂包括聚乙二醇。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述高盐溶液包括氯化钠溶液...
【专利技术属性】
技术研发人员：金百胜，张婉君，魏晴，夏平安，
申请(专利权)人：常熟纳微生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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