【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及结核分枝杆菌致病蛋白rv2610或其编码基因作为设计、筛选抗结核药物的重要靶标位点在制备抗结核分枝杆菌感染药物中的应用。
技术介绍
1、结核病(tuberculosis，tb)是一种严重危害人类和动物健康的慢性传染病，结核分枝杆菌所致结核病是人畜共患的结核病。
2、结核多重耐药患者数目增长非常迅速，新患者中耐多药/利福平耐药患者的比例为3.3％、复治患者中的比例为17％。如此庞大的数据告诉我们，治疗结核病迫在眉睫。现临床上为了避免药物治疗期间耐药性的出现，多采用抗结核药物联合用药的给药方案，但也无疑加重了患者的负担。因此发掘抗结核感染的新靶标和研发新型抗结核药物已成为目前最受关注的问题。
3、结核分枝杆菌(mycobactreium tuberculosis，mtb)生长缓慢，它在世界范围内广泛传播和致病得益于其强大的生存能力。现今已确定结核分枝杆菌的细胞壁有利于它在感染的寄主内存活，而且目前较为有效的抗结核药物也是作用于细胞壁成分的代谢途径的。脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannans，lam)是最有潜力的可以调节宿主免疫反应的非肽类分子，是分枝杆菌的细胞壁上独特的糖脂。基于此，lam在结核分枝杆菌和宿主的相互作用和影响免疫反应中发挥重要作用。
4、巨噬细胞是结核分枝杆菌寄生的主要宿主细胞。部分结核分枝杆菌可逃避宿主免疫系统、尤其是巨噬细胞的追杀，在被吞噬到巨噬细胞的吞噬体以后，能够成功阻止吞噬体与溶酶体的融合，抑制吞噬溶酶体的成熟，从而阻止了自身被溶
5、鉴定并解析结核分枝杆菌的致病性基因，尤其是与入侵寄主巨噬细胞过程相关的功能基因，可以为设计、筛选抗结核药物提供重要的靶标位点。采用分子生物学技术，克隆及鉴定新的在结核菌入侵过程中发挥重要功能的致病基因，可为设计与筛选新型结核药剂提供重要的药物靶点，这对结核病的综合防治具有十分重要的理论意义和应用价值。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种能显著促进结核分枝杆菌对宿主巨噬细胞粘附能力并且抑制炎症的致病性结核分枝杆菌的蛋白rv2610或其编码基因的应用，rv2610可作为抗结核感染新的药物靶标。rv2610是结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖合成途径中的负责第一步合成——将第一个甘露糖残基从gdp-甘露糖(gdp-mannose)转移到磷脂酰肌醇(phosphatidyl-myo-inositol，pi)的肌醇部分的c-2位，形成磷脂酰肌醇单甘露糖苷(phosphatidyl-myo-inositol mannosides，pim1)的关键甘露糖基转移酶。rv2610基因编码序列全长为1137bp，序列如seq id no:1所示；rv2610蛋白的长度为378aa，蛋白大小为40kd，氨基酸序列如seq id no:2所示。目前rv2610所参与的lam合成路径中的具体反应已被发现和阐明，并且大多数的研究成果都集中在其蛋白结构方面，未有人进一步研究rv2610在细菌生理过程中及与宿主巨噬细胞互作中的影响和意义。
2、为实现上述目的，本专利技术技术方案如下：
3、本专利技术通过设计rv2610的引物，并以结核分枝杆菌h37rv基因组为模板，进行pcr扩增。之后将其构建至pmv261原核表达载体上，同时将该重组质粒电转至耻垢分枝杆菌感受态(m.smegmatis，m.s)中。挑单克隆摇菌，pcr及western blot验证阳性克隆菌落后，用重组耻垢分枝杆菌rm.s::rv2610分别感染小鼠巨噬细胞系raw264.7、pma(佛波酯)刺激分化后的人类巨噬细胞系thp1和骨髓来源的巨噬细胞(the bone marrow-derivedmacrophage，bmdm)30分钟。对于粘附实验，感染30分钟后，弃培养基，pbs洗三次，裂解细胞，将裂解液涂布于卡那霉素抗性(kanr)固体培养基上进行菌落计数。对于侵入实验，感染30分钟后，用庆大霉素处理细胞30分钟，以去除并杀死细胞外未入侵的细菌，继续培养30分钟后用pbs清洗三次，将洗后的细胞裂解，裂解液涂布于卡那霉素抗性固体培养基上进行菌落计数。结果显示相比于侵入实验，粘附实验中rm.s::rv2610与对照组相比，产生了更多的菌落数，且具有统计学意义。因此，筛选出能促进结核分枝杆菌对巨噬细胞粘附能力的功能性基因rv2610。rv2610还能抑制巨噬细胞早期炎症分子tnf-α和il-1β表达。并在动物模型中验证了rv2610基因促进细菌的定植和致病性。除此之外，通过crispri-cas9技术构建rv2610的h37ra敲低(knockdown)细菌，用该细菌感染bmdm、在不同时间点进行细菌计数，发现rv2610的损耗能显著的降低结核分枝杆菌在巨噬细胞中的存活。
4、因此，结核分枝杆菌rv2610蛋白或其编码基因能够作为药物筛选的靶标，抑制rv2610蛋白活性的药物或抑制rv2610基因表达的药物可用于抑制结核分枝杆菌对宿主巨噬细胞的粘附能力，从而抵抗结核分枝杆菌的感染。
5、本专利技术的第一方面，提供rv2610在制备抗结核分枝杆菌感染的药物中的应用。进一步的，该应用中rv2610是作为药物筛选的靶点，筛选能够抑制rv2610基因表达或抑制rv2610蛋白活性，从而抑制结核分枝杆菌感染宿主巨噬细胞和/或促进巨噬细胞早期炎症分子tnf-α和il-1β表达的药物。
6、本专利技术的第二方面，提供rv2610的抑制剂在制备抗结核分枝杆菌感染的药物中的应用。所述的rv2610的抑制剂包括抑制rv2610基因表达的物质、抑制rv2610蛋白活性的物质；所述的抑制rv2610基因表达的物质包括sirna、dsrna、shrna、sgrna等，以及干扰载体、敲除载体等；所述的抑制rv2610蛋白活性的物质包括rv2610蛋白的抗体、表达rv2610蛋白抗体的质粒、能与rv2610蛋白结合抑制rv2610蛋白活性的化合物等。
7、在一些实施方案中，所述的抑制rv2610基因表达的物质为基于crispri-cas9的基因敲低载体，载体上的sgrna优选由下述引物退火得到：
8、rv2610-sgrnaf：gggatccggcgtcgtccacctgac，
9、rv2610-sgrnar：aaacgtcaggtggacgacgccgga。
10、本专利技术的第三方面，提供rv2610在制备结核分枝杆菌疫苗中的应用，所述的应用为敲除或敲低结核分枝杆菌的rv2610基因减弱其对宿主的感染力提高疫苗的安全性。进一步的，提供一种结核分枝杆菌疫苗，其为敲除或敲低包括rv2610基因的结核分枝杆菌。
11、本专利技术的第四方面，提供rv2610在开发抑制结核分枝杆菌感染宿主巨噬细胞的抑制剂中的应用，所述的抑制结核分枝杆菌感染宿主巨噬细胞的抑制剂可为rv2610的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.Rv2610在制备抗结核分枝杆菌感染的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的应用为Rv2610作为药物筛选的靶点，筛选能够抑制Rv2610基因表达或抑制Rv2610蛋白活性，从而抑制结核分枝杆菌感染宿主巨噬细胞的药物。
3.Rv2610的抑制剂在制备抗结核分枝杆菌感染的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的Rv2610的抑制剂包括抑制Rv2610基因表达的物质、抑制Rv2610蛋白活性的物质。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的抑制Rv2610基因表达的物质包括siRNA、dsRNA、shRNA、sgRNA，干扰载体、敲除载体；所述的抑制Rv2610蛋白活性的物质包括Rv2610蛋白的抗体、表达Rv2610蛋白抗体的质粒、抑制Rv2610蛋白活性的化合物。
6.Rv2610在制备结核分枝杆菌疫苗中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的应用为敲除或敲低结核分枝杆菌的Rv2610基因减弱其对宿主的感染力提高疫苗的安全性。p>
8.一种结核分枝杆菌疫苗，其特征在于：为敲除或敲低包括Rv2610基因的结核分枝杆菌。
9.Rv2610在开发抑制结核分枝杆菌感染宿主巨噬细胞的抑制剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的抑制结核分枝杆菌感染宿主巨噬细胞的抑制剂为Rv2610的抑制剂。
...【技术特征摘要】
1.rv2610在制备抗结核分枝杆菌感染的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的应用为rv2610作为药物筛选的靶点，筛选能够抑制rv2610基因表达或抑制rv2610蛋白活性，从而抑制结核分枝杆菌感染宿主巨噬细胞的药物。
3.rv2610的抑制剂在制备抗结核分枝杆菌感染的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的rv2610的抑制剂包括抑制rv2610基因表达的物质、抑制rv2610蛋白活性的物质。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的抑制rv2610基因表达的物质包括sirna、dsrna、shrna、sgrna，干扰载体、敲除载体；...
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