【技术实现步骤摘要】
本公开涉及生物检测，尤其涉及一种同时检测细胞外囊泡表面多种膜蛋白的方法。
技术介绍
1、细胞外囊泡（extracellular vesicles，evs）是指细胞释放到细胞外体液环境中的具有磷脂双分子膜结构的异质微小生物囊泡。根据evs的尺寸大小，可将其分为小细胞外囊泡（sevs，<200 nm），大细胞外囊泡（levs，>200 nm）。sevs广泛存在于细胞培养上清液和各种体液中（如汗液、血液、尿液和脑脊液等）。sevs的膜表面含有大量膜蛋白，这些蛋白质的种类和相对丰度因亲代细胞类型和微环境的不同而存在异质性，这种异质性的存在使得不同sevs亚群能够提供疾病状态的重要生物学信息，具有应用于疾病诊断和检测的潜力。
2、然而，sevs的异质性以及体液的复杂性给sevs的深入研究来了巨大的挑战。对特定的蛋白阳性sevs亚群进行分类和分析，对于更准确地了解sevs的生物学意义至关重要。sevs亚群检测方法主要分为两类，一类是无标记方法，如冷冻电子显微镜(cryo-em)、原子力显微镜(afm)、纳米颗粒跟踪分析(nta)、拉曼镊子显微光谱(rtm)、单粒子干涉反射成像传感器(sp-iris)等，这类方法主要用于表征sevs的形态、浓度、尺寸分布和表面蛋白质等信息，但通量较低，提供的信息有限，且检测灵敏度较低；另一类则是基于荧光标签的标记方法，如高分辨率流式细胞术 (hrfc)、数字液滴pcr (ddpcr)、超分辨率显微镜 (srm)、荧光显微镜等方法，相较于以上的无标记方法，这些方法实现了更高的灵敏度和特异
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本公开提供了一种同时检测细胞外囊泡表面多种膜蛋白的方法，所述方法基于本公开所述的生物传感器，开发了一种“电学夹心”测定方法，实现了同时含有多种细胞外囊泡膜蛋白的快速无标记电学检测，具有较好的应用前景。
2、本公开提供了一种同时检测细胞外囊泡表面多种膜蛋白的方法，所述方法采用生物传感器进行，所述生物传感器由硅纳米线器件与聚二甲基硅氧烷微流体通道键合而成，所述硅纳米线器件的表面设置有硅纳米线，且所述硅纳米线位于所述聚二甲基硅氧烷微流体通道中；
3、所述方法包括以下步骤：
4、（1）对生物传感器中的硅纳米线器件进行表面改性，然后将第一待检测膜蛋白的抗体修饰到硅纳米线器件的硅纳米线上，再将对照溶液通入所述生物传感器的聚二甲基硅氧烷微流体通道中，进行电学检测，得到基础阈值电压；
5、（2）将含有细胞外囊泡的溶液通入所述生物传感器的聚二甲基硅氧烷微流体通道中，使表达了第一待检测膜蛋白的细胞外囊泡与所述第一待检测膜蛋白的抗体进行反应，然后进行电学检测，得到第一阈值电压；
6、，反映了细胞外囊泡中第一待检测膜蛋白的表达水平；
7、（3）依次测量得到第二待检测膜蛋白的抗体至第n待检测膜蛋白的抗体对应的阈值电压，其中，n为大于1的整数；
8、每种待检测膜蛋白的抗体对应的阈值电压的测定步骤包括：
9、将含有第m待检测膜蛋白的抗体的溶液通入所述生物传感器的聚二甲基硅氧烷微流体通道中，使第m待检测膜蛋白的抗体与表达了第m待检测膜蛋白的细胞外囊泡进行反应，然后进行电学检测，得到第m阈值电压；其中，m为2至n中的任意整数；
10、所述第m待检测膜蛋白的抗体偶联有单链dna；
11、，，，反映了细胞外囊泡中第m待检测膜蛋白的表达水平。
12、本公开基于所述的生物传感器，提供了一种“电学夹心”测定方法，并通过在第二待检测膜蛋白的抗体至第n待检测膜蛋白的抗体上各自独立地偶联带负电的单链dna增大了抗体的负电荷，从而增强其与细胞外囊泡表面膜蛋白结合时的电学响应，所述方法可实现对同时含有多种细胞外囊泡表面膜蛋白的sevs亚型的检测；此外，与现有的两种常规检测方法相比，操作简单直接、灵敏度高，无需依赖杂交链反应（hcr）、滚环扩增（rca）等复杂的信号放大策略，在生物检测领域具有重要的意义。
13、其中，“电学夹心”是指“第一待检测膜蛋白的抗体+细胞外囊泡+第二待检测膜蛋白的抗体至第n待检测膜蛋白的抗体”的结构。
14、以下作为本公开优选的技术方案，但不作为本公开提供的技术方案的限制，通过以下技术方案，可以更好地达到和实现本公开的技术目的和有益效果。
15、作为本公开优选的技术方案，所述细胞外囊泡包括尺寸小于200nm的小细胞外囊泡。
16、作为本公开优选的技术方案，所述硅纳米线器件包括p型硅纳米线器件。
17、作为本公开优选的技术方案，步骤（1）中，对生物传感器中的硅纳米线器件进行表面改性的步骤包括：
18、采用硅烷化试剂对所述生物传感器中的硅纳米线器件的表面进行硅烷化改性，使纳米线器件的表面接枝氨基；然后采用醛基化试剂进行醛基化改性，使醛基化试剂的任意一端醛基与硅纳米线器件表面的氨基结合，完成表面改性。
19、优选地，所述硅烷化试剂包括3-氨基丙基三乙氧基硅烷。
20、优选地，所述醛基化试剂包括戊二醛水溶液。
21、作为本公开优选的技术方案，步骤（1）中，将第一待检测膜蛋白的抗体修饰到硅纳米线器件的硅纳米线上的步骤包括：
22、将含有第一待检测膜蛋白的抗体的溶液通入所述生物传感器的聚二甲基硅氧烷微流体通道中，使所述第一待检测膜蛋白的抗体表面的氨基与所述醛基化试剂的另一端醛基发生反应，从而将第一待检测膜蛋白的抗体接枝到硅纳米线器件的硅纳米线上；然后再采用封闭液封闭硅纳米线器件表面的非特异性反应位点。
23、优选地，所述含有第一待检测膜蛋白的抗体的溶液中，所述第一待检测膜蛋白的抗体的浓度为45~55μg/ml，例如45μg/ml、47μg/ml、50μg/ml、53μg/ml或55μg/ml等，但并不限于所列举的数值，该范围内其他未列举的数值同样适用。
24、优选地，所述封闭液包括bsa溶液。
25、作为本公开优选的技术方案，步骤（1）所述对照溶液包括pbs溶液。
26、作为本公开优选的技术方案，步骤（2）所述含有细胞外囊泡的溶液中，细胞外囊泡的浓度为1×109~ 3×109个/ml，例如1×109个/ml、2×109个/ml或3×109个/ml等，但并不限于所列举的数值，该范围内其他未列举的数值同样适用。
27、作为本公开优选的技术方案，步骤（3）中，所述单链dna的核苷酸数目不少于10，例如10、15、20、25、30或35等，但并不限于所列举的数值，该范围内其他未列举的数值同样适用，优选为10~30，进一步本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种同时检测细胞外囊泡表面多种膜蛋白的方法，其特征在于，所述方法采用生物传感器进行，所述生物传感器由硅纳米线器件与聚二甲基硅氧烷微流体通道键合而成，所述硅纳米线器件的表面设置有硅纳米线，且所述硅纳米线位于所述聚二甲基硅氧烷微流体通道中；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞外囊泡包括尺寸小于200nm的小细胞外囊泡。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述硅纳米线器件包括P型硅纳米线器件。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，对生物传感器中的硅纳米线器件进行表面改性的步骤包括：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，将第一待检测膜蛋白的抗体修饰到硅纳米线器件的硅纳米线上的步骤包括：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述硅烷化试剂包括3-氨基丙基三乙氧基硅烷；
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述对照溶液包括PBS溶液；
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述单链DNA的核苷酸数目
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述含有第m待检测膜蛋白的抗体的溶液中，所述第m待检测膜蛋白的抗体的浓度为45~55μg/mL。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）和步骤（3）中，每种待检测膜蛋白的抗体与细胞外囊泡反应后，均采用PBS溶液对所述生物传感器的聚二甲基硅氧烷微流体通道进行清洗，除去未反应的物质，再进行电学检测。
...【技术特征摘要】
1.一种同时检测细胞外囊泡表面多种膜蛋白的方法，其特征在于，所述方法采用生物传感器进行，所述生物传感器由硅纳米线器件与聚二甲基硅氧烷微流体通道键合而成，所述硅纳米线器件的表面设置有硅纳米线，且所述硅纳米线位于所述聚二甲基硅氧烷微流体通道中；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞外囊泡包括尺寸小于200nm的小细胞外囊泡。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述硅纳米线器件包括p型硅纳米线器件。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，对生物传感器中的硅纳米线器件进行表面改性的步骤包括：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，将第一待检测膜蛋白的抗体修饰到硅纳米线器件的硅纳米线上的步骤包...
【专利技术属性】
技术研发人员：覃美研，赵海苹，李明虓，吉训明，
申请(专利权)人：首都医科大学宣武医院，
类型：发明
国别省市：
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