【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因检测领域，尤其涉及一种dlat基因用于奇楠沉香和白木香鉴定的方法。
技术介绍
1、根据对奇楠沉香的成分检测，发现其主要成分为2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮和2-(2-苯乙基)色酮，这两种成分是现行标准下野生奇楠沉香的主要成分，对于沉香质量的精细分级具有重要作用。普通白木香不如这种“奇楠”种质结香多、结香快，而且不含2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮和2-(2-苯乙基)色酮或含量很少。但普通白木香所结的沉香中5,6,7,8-四氢-2-(-苯乙基)色酮(沉香四醇)含量比这些易结香种植所结的香高。根据2020年颁布的《中国药典》，沉香四醇是沉香入药的主要有效性成分。
2、在化学组成方面，有许多研究发现奇楠沉香富含2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮和2-(2-苯乙基)色酮。基于此，2017年的海南省地方性标准和2020年的国家林业和草原局行业标准将乙醇提取物含量和2-(2-苯乙基)色酮和2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮两种成分的总含量结合，将沉香分为特级、一级、二级、三级、四级五个级别。目前，通过这两种特征成分对沉香的等级进行评价，已逐渐成为沉香品质研究的趋势。
3、研究表明，沉香中的化学成分主要包括倍半萜类成分、2-(2-苯乙基)色酮类衍生物以及芳香族化合物。2-(2-苯乙基)色酮类衍生物是沉香中的主要成分之一，可根据骨架类型分为四个类型，分别为5,6,7,8-四氢-2-(2-苯乙基)色酮、5,6,7,8-二环氧-2-(2-苯乙基)色酮、2-(2-苯乙基)色酮、5,6-环氧-2-
4、虽然已有沉香基因组相关文献，但目前从基因组水平对奇楠沉香和普通白木香之间的差异研究尚未有文献发表及相关技术专利。对于奇楠沉香与白木香在遗传上是否具有差异，是否有具体相关功能基因基因型的差异导致最终结香成分的差异并不明确。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足，提供了一种dlat基因用于奇楠沉香和白木香鉴定的方法。具体开发过程：
2、一、沉香基因组dna提取
3、表1沉香全基因组测序材料
4、
5、选取如表1所示的沉香样品材料进行全基因组测序，沉香基因组的提取采用的是天根生物公司的多糖多酚试剂盒法。具体实验过程如下：
6、步骤1)取100mg鲜嫩沉香叶片放在提前消毒烘干的研钵中，加入适量液氮充分研磨至粉末状。
7、步骤2)将研磨好的粉末转移至1.5ml无菌离心管中，吸取400μl缓冲液gps迅速加入其中，再加入10μl rnase，涡旋混匀，然后将离心管放在恒温金属浴中65℃恒温15min，恒温加热过程每五分钟颠倒离心管，以使样品充分溶解。
8、步骤3)将100μl缓冲液gpa加入离心管中，涡旋振荡1min，然后12,000rpm离心5min。提前将过滤柱cs放在收集管中，再将离心所得上清液转移至过滤柱cs，然后12,000rpm离心1min，将收集管中的滤液转移至新的离心管。此时若发现滤液粘稠度高，可以再加入适量缓冲液gpa，涡旋混匀后将离心管置于冰上静置5min，然后再次离心。
9、步骤4)加入与滤液等体积的无水乙醇，充分混匀。
10、步骤5)提前将吸附柱cr2放在收集管中，将混匀后的溶液及产生的絮状物都转移到rnase-free吸附柱cr2中，12,000rpm离心1min，倒掉滤液，将rnase-free吸附柱cr2放回收集管。
11、步骤6)按照包装盒上的推荐用量往蛋白液rd里加入无水乙醇，再吸取550μl去蛋白液rd加入到rnase-free吸附柱cr2中，12,000rpm离心1min，倒掉滤液，将rnase-free吸附柱cr2放回收集管。
12、步骤7)按照包装盒上的推荐用量往漂洗液pw里加入无水乙醇，再吸取700μl漂洗液pw加入rnase-free吸附柱cr2中，12,000rpm离心1min，倒掉滤液，将rnase-free吸附柱cr2放回收集管。此步骤共重复做两次。
13、步骤8)12,000rpm离心2min，弃收集管，然后将rnase-free吸附柱cr2转移到新的离心管中，室温晾干5-10min。
14、步骤9)吸取50-100μl洗脱缓冲液tb加入rnase-free吸附柱cr2中，室温放置5min，12,000rpm离心2min，离心管中所得溶液即为沉香基因组dna。
15、步骤10)将提取成功的dna放在-20℃冰箱保存，以防降解。
16、二、沉香基因组dna的质量测定
17、采用1％琼脂糖凝胶电泳检测所提取的沉香基因组dna的质量，bio rad gel docxr凝胶图像采集与分析仪采集电泳条带图像。采用thermo scientific nanodrop 1000核酸分析仪检测所提dna浓度和纯度。
18、三、dna文库构建与高通量测序
19、检测合格后的样品根据illumina dna文库构建标准流程，构建插入片段大小为350bp的双末端测序文库。文库构建完成后以qpcr方法和agilent 2100bioanalyzer进行质控。对质检合格的dna文库采用illumina novaseq 6000高通量测序平台进行测序，测序策略为双端150bp测序。
20、四、序列比对与snp检测
21、序列比对采用bwa软件，双末端比对策略。将测序数据比对到已发表的沉香基因组(ncbi登录号：gca_005392925.1)。使用deepvariant软件进行snp检测。
22、五、hp和fst分析与编码基因位点选择
23、hp和fst分析，hp表示pooled heterozygosity score:
24、(carl-johan rubin et al.2010)，其中表示观察窗口中最大基因型的和，相应表示最小基因型的和。hp的范围是0～0.5，当hp等于0.5时，表示和相等，说明群体中两种基因型相等，而当hp值等于0时，表示只有一种基因型。
25、fst(固定系数)采用r语言软件包hierfstat(版本：0.5-11)，fst值的范围是0～1，0表示该基因型完全没有被固定，在不同群体中的碱基比例相同(对应各群体的hp等于0.5)，fst值等于1表示两个群体间的基因型完全不相同(对应各群体的hp等于0，且两个群体的基因型不相同)。
26、因此，选择白木香群体内hp值等于0，且在奇楠沉香群体内hp值等于0，对应fst值为1的snp位点为目标位点，如表2所示，snp位点基因功能注释如表3所示。
27、表2snp位点hp和fst值统计表
28、
29、表3snp位点基因功能注释
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【技术保护点】
1.一种DLAT基因用于奇楠沉香和白木香鉴定的方法，其特征在于：以奇楠沉香DLAT基因型为TT、白木香DLAT基因型为CC为依据进行奇楠沉香和白木香的鉴定。
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：所述方法为：以奇楠沉香和白木香的DLAT基因编码区1879号碱基为目标位点，采用PCR与Sanger测序的方法，对DLAT基因PCR扩增产物进行Sanger测序，如DLAT基因型为TT则为奇楠沉香，如DLAT基因型为CC则为白木香。
3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于：鉴定DLAT基因PCR扩增使用的引物名称为Pri-F，Pri-R，引物长度分别为19bp、19bp，扩增长度379bp，序列为GTCGCTACTACCGATTGA、TCCCTTCCAGGAGACTTG，退火温度为58℃。
4.权利要求1所述的鉴定方法用于奇楠沉香的种质鉴定。
【技术特征摘要】
1.一种dlat基因用于奇楠沉香和白木香鉴定的方法，其特征在于：以奇楠沉香dlat基因型为tt、白木香dlat基因型为cc为依据进行奇楠沉香和白木香的鉴定。
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：所述方法为：以奇楠沉香和白木香的dlat基因编码区1879号碱基为目标位点，采用pcr与sanger测序的方法，对dlat基因pcr扩增产物进行sanger测序，如dlat基因型为t...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘天颐，黄少伟，黄光亮，罗洁贤，李增，顾雨梦，黄雄瑶，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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