【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种用于基因与细胞治疗的新型腺相关病毒变体库及其构建和应用。
技术介绍
1、腺相关病毒（aav）是一种直径约26纳米的小型无包膜病毒，其病毒颗粒由正二十面体的衣壳蛋白和约4.7 kb的单链dna基因组组成。aav作为基因治疗中的关键病毒载体，凭借其高安全性、低免疫原性等特性，在基因治疗领域取得了显著成就，其中已有7款aav基因疗法获批上市，此外，有工作报道利用人工智能指导设计新型aav衣壳，发现产生的可用突变体明显优于随机诱变，为aav衣壳蛋白的工程化提供了一种有力的设计方式。在当前发现的血清型中，包括天然的13种以及一些变体，aav6在体外转导人体免疫细胞方面展现出卓越的优势，特别是在与基因编辑技术（如crispr）结合后，为难以靶向的细胞类型（如原代t细胞）的基因工程改造提供了新的可能，例如将原代t细胞生产为具有免疫治疗效果的嵌合抗原受体t细胞（chimeric antigen receptor t cell，car-t cell）。尽管aav6在转导人体免疫细胞方面具有优势，但其转导效率仍无法满足实际应用的需求，限制了aav6在基因治疗中的广泛应用；由于转导效率的限制，当前仍依赖使用高病毒感染复数（moi，1×106）进行基因递送，不仅增加了生产成本，还可能导致潜在的毒副作用风险；现有的基于aav6的突变体库多样性较为有限，缺乏针对人免疫细胞的大规模病毒突变体库，这限制了aav6衣壳蛋白改造潜力的充分挖掘。
2、为了解决上述问题，研究者们开始探索工程化aav衣壳蛋白的方法，以
3、尽管已有aav6的改造方法，如单点突变和cap蛋白的片段重组，但这些改造未能显著提升其对人免疫细胞的转导效率，仍无法满足实际应用的需求。其次，由于转导效率的限制，当前仍依赖使用高moi（病毒感染复数）进行基因递送，这不仅导致了生产成本的增加，还增加了潜在的毒副作用风险，此外，现有的突变体库多样性较为有限，缺乏针对人免疫细胞的基于aav产生的大规模病毒突变体库，未能充分挖掘aav衣壳蛋白的全部改造潜力。
技术实现思路
1、鉴于现有aav改造方法无法显著提高对人免疫细胞转导效率，需要高病毒感染复数进行基因传递增加毒副作用风险的问题，现有aav突变体库多样性不足，缺乏专门针对人免疫细胞、基于aav构建的大规模病毒突变体库的技术现状。本专利技术旨在于提供一种用于基因与细胞治疗的新型腺相关病毒变体库的构建方法。
2、为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
3、本专利技术提供一种用于基因与细胞治疗的新型腺相关病毒变体库的构建方法，包括：
4、s1，基于天然血清型腺相关病毒的cap基因的氨基酸序列，识别腺相关病毒非保守区域，基于腺相关病毒非保守区域进行单点饱和突变，生成腺相关病毒单点饱和突变体库；
5、s2，基于腺相关病毒单点饱和突变体病毒库，采用高通量寡核苷酸dna序列合成引入单点突变，构建腺相关病毒突变体质粒库；
6、s3，基于腺相关病毒突变体质粒库，构建腺相关病毒突变体病毒库；
7、s4，基于腺相关病毒突变体病毒库，筛选，提取基因组，测序鉴定，获得用于基因与细胞治疗的新型腺相关病毒变体库。
8、所述天然血清型腺相关病毒为aav1，aav2，aav3，aav4，aav5，aav6，aav7，aav8，aav9，aav10，aav11，aav12和aav13中的任意一种。
9、进一步的，所述天然血清型腺相关病毒为aav6。
10、s1中，采用clustal omega工具比对cap基因的氨基酸序列。
11、s2具体包括：
12、s21，根据腺相关病毒的cap基因序列，利用高通量寡核苷酸dna序列合成包含单点突变的寡核苷酸dna序列；
13、s22，设计8bp barcode序列，在每条包含单点突变的寡核苷酸dna序列中加入8bp的barcode；
14、s23，采用两轮goldengate assembly策略，将带有单点突变的寡核苷酸与barcode插入到cap6基因中的对应位置；
15、s24，通过电转化、涂布计数、摇菌，提取质粒，构建腺相关病毒突变体质粒库。
16、进一步地，8bp barcode序列采用python或matlab 软件设计。
17、s3具体包括：获取辅助质粒、包装质粒和目标质粒；利用磷酸钙转染法将质粒转染至293lx细胞，病毒包装；收集纯化病毒，滴度检测获得突变体病毒库。
18、s4包括：将腺相关病毒突变体病毒库病毒接种至免疫细胞，药物筛选成功转导病毒的细胞；培养后提取基因组测序分析，鉴定，获得用于基因与细胞治疗的新型腺相关病毒变体库。
19、所述药物筛选成功转导病毒的细胞，采用嘌呤霉素筛选。
20、上述的构建方法获得的用于基因与细胞治疗的新型腺相关病毒变体库。
21、上述新型腺相关病毒变体库在制备基因与细胞治疗药物中的应用。
22、上述新型腺相关病毒变体库在筛选转导效率高且安全新型腺相关病毒衣壳蛋白变体中的应用。
23、一种新型腺相关病毒衣壳蛋白变体，所述新型腺相关病毒衣壳蛋白变体由上述用于基因与细胞治疗的新型腺相关病毒变体库筛选获得。
24、进一步地，所述筛选包括体外构建新型病毒载体以及在人原代t细胞中进行测试步骤。
25、进一步地，所述新型腺相关病毒衣壳蛋白变体为新型aav6变体p482l。
26、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
27、本专利技术提供的用于基因与细胞治疗的新型腺相关病毒变体库的构建方法，本专利技术通过高通量测序、基因编辑等技术手段，构建了一个包含大量突变体的新型aav变体库，该方法不仅提高了构建效率，还保证了突变体的多样性和随机性，为后续的筛选和应用提供了丰富的资源；该构建方法通过定点突变技术，对aav6的cap基因进行改造，以期获得具有特定生物学特性的新型腺相关病毒变体病毒库；通过识别非保守区域并进行单点饱和突变，能够显著增加aav突变体的多样性，有望筛选出对人免疫细胞转导效率更高的aav变体，解决了现有aav改造方法无法显著提高对人免疫细胞转导效率的问题；从而满足基因与本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于基因与细胞治疗的新型腺相关病毒变体库的构建方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述一种用于基因与细胞治疗的新型腺相关病毒变体库的构建方法，其特征在于，所述天然血清型腺相关病毒为AAV1，AAV2，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9，AAV10，AAV11，AAV12和AAV13中的任意一种。
3.根据权利要求1所述一种用于基因与细胞治疗的新型腺相关病毒变体库的构建方法，其特征在于，S1中，采用Clustal Omega工具比对cap基因的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述一种用于基因与细胞治疗的新型腺相关病毒变体库的构建方法，其特征在于，S2具体包括：
5.根据权利要求1所述一种用于基因与细胞治疗的新型腺相关病毒变体库的构建方法，其特征在于，S3具体包括：获取辅助质粒、包装质粒和目标质粒；利用磷酸钙转染法将质粒转染至293LX细胞，病毒包装；收集纯化病毒，滴度检测获得新型腺相关病毒突变体病毒库。
6.根据权利要求1所述一种用于基因与细胞治疗的新型腺相关病毒变体库的构
7.根据权利要求1~6任意一项所述的构建方法获得的用于基因与细胞治疗的新型腺相关病毒变体库。
8.根据要求7所述的新型腺相关病毒变体库在制备基因与细胞治疗药物中的应用。
9.根据要求7所述的新型腺相关病毒变体库在筛选转导效率高且安全新型腺相关病毒衣壳蛋白变体中的应用。
10.一种新型腺相关病毒衣壳蛋白变体，其特征在于，所述新型腺相关病毒衣壳蛋白变体由权利要求7所述用于基因与细胞治疗的新型腺相关病毒变体库筛选获得。
...【技术特征摘要】
1.一种用于基因与细胞治疗的新型腺相关病毒变体库的构建方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述一种用于基因与细胞治疗的新型腺相关病毒变体库的构建方法，其特征在于，所述天然血清型腺相关病毒为aav1，aav2，aav3，aav4，aav5，aav6，aav7，aav8，aav9，aav10，aav11，aav12和aav13中的任意一种。
3.根据权利要求1所述一种用于基因与细胞治疗的新型腺相关病毒变体库的构建方法，其特征在于，s1中，采用clustal omega工具比对cap基因的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述一种用于基因与细胞治疗的新型腺相关病毒变体库的构建方法，其特征在于，s2具体包括：
5.根据权利要求1所述一种用于基因与细胞治疗的新型腺相关病毒变体库的构建方法，其特征在于，s3具体包括：获取辅助质粒、包装质粒和目标质粒；利用磷酸钙转染法将...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏平，范盈盈，姜思琦，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：
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