【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本文提供了用于调控肽功能的方法、组合物、试剂盒和系统。具体而言，本文提供了包含核酸构建体和融合蛋白的方法、组合物、试剂盒和系统，所述融合蛋白包含在存在配体的情况下调控融合肽的活性的化学活化蛋白质结构域(cap)。
技术介绍
1、天然的或经工程化的肽通过作为二聚化对的配偶体1、酶活性的抑制剂2,3、以及蛋白质定位的调节剂4,5、降解6,7和剪接8来发挥生物学功能。利用使用者定义的信号(诸如光或化学物质)进行的肽功能的活化能够通过时间控制来操纵多种生物学过程。实现这种控制的一种方式是使用经化学修饰的合成肽，该经化学修饰的合成肽包含可移除的保护基团9或基于偶氮苯的发色团10。虽然这些方法在体外是有用的，但是由于向细胞递送以及随后外部肽降解的挑战，它们在内源性生物环境中的使用受到限制。控制肽功能的另一种方式是使用经遗传编码的蛋白质结构域7,11。通过在存在光或小分子的情况下使肽与改变肽的构象的蛋白质的融合可以实现肽的闭笼和解笼。这种方法允许将肽通过遗传方式引入活生物体中并表达细胞类型特异性蛋白质，因此适合于生物学研究。来自燕麦(avenasativa)向光素1的第二光、氧气、电压感知结构域(aslov2)已经被用作控制肽功能的蛋白质结构域2,6,11-16。aslov2通过控制与其融合的肽的n-末端的可及性来发挥作用。在黑暗中，肽被aslov2阻断；在光照下，aslov2中发生构象变化，因此肽被释放并变为可及的17,18。虽然光提供了快速时间控制，但是由于组织穿透性较差，其在不透明生物体中的使用受到限制19。相比之下，化学物质可以容易地
2、因此，需要基于小分子的新型蛋白质开关和门控模块来控制其他肽的功能。
技术实现思路
1、本文提供了用于调控肽功能的方法、组合物、试剂盒和系统。具体而言，本文提供了包含核酸构建体和融合蛋白的方法、组合物、试剂盒和系统，所述融合蛋白包含在存在配体的情况下调控融合肽的活性的化学活化蛋白质结构域(cap)。
2、在一些实施方案中，本专利技术提供了一种调控肽的活性的方法，其包括产生核酸构建体，所述核酸构建体包含编码包含配体结合位点的至少一个化学活化蛋白质结构域(cap)的核酸和编码肽的核酸；将所述核酸构建体施用于一个或多个细胞以产生融合蛋白，其中所述融合蛋白包含连接至所述肽的所述至少一个cap；以及将配体施用于所述一个或多个细胞，其中所述配体结合至所述融合蛋白的所述cap的所述配体结合位点，其中所述配体的所述施用增加所述肽的所述活性。在一些实施方案中，至少一个cap包含结合至肽的n-末端的capn，和/或结合至肽的c-末端的capc。在一些实施方案中，核酸构建体的施用包括核酸构建体的直接注射、大分子介导的脂质体和/或生物聚合物基因递送、质粒递送、和/或病毒递送。在一些实施方案中，病毒递送选自由以下各项组成的组：腺相关病毒(aav)递送、腺病毒递送、慢病毒递送、痘苗病毒递送和逆转录病毒递送。在一些实施方案中，核酸构建体被稳定表达或瞬时表达。在一些实施方案中，表达是细胞内表达或细胞外表达。
3、在一些实施方案中，配体结合位点包含fkbp结合结构域。在一些实施方案中，肽是ssra、核定位信号肽(nls)、核输出信号肽或tev蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，肽是酶活化肽、酶抑制肽、酶调控肽、结合肽、定位肽或降解肽。在一些实施方案中，配体是shield-1和/或aquashield-1。
4、在一些实施方案中，施用是肠胃外施用和/或非肠胃外施用。在一些实施方案中，一个或多个细胞是体外细胞或体内细胞。在一些实施方案中，体内细胞是神经元细胞或肝细胞。在一些实施方案中，核酸构建体包含编码选自由以下各项组成的组的至少一种核酸：aga2p、报告基因、tetr dbd、sspb、vp16、p2a、接头、flag、uas-mcherry和内部核糖体进入位点(ires)。在一些实施方案中，核酸构建体还包含选自由以下各项组成的组的启动子核酸：cmv、cag和突触蛋白。
5、在一些实施方案中，本专利技术的方法还包括目的蛋白质(poi)。在一些实施方案中，poi是转录因子、激酶、基因编辑酶或标记。在一些实施方案中，poi是进化的绿色荧光蛋白(egfp)。在一些实施方案中，本专利技术的方法还包括测量肽的活性，其中所述测量包括测量肽的定位、结构和/或功能。在一些实施方案中，本专利技术提供了用于细胞内小肽、大肽或蛋白质的结构、功能和定位的时间、使用者控制调控的通用机制和/或模块。
6、在一些实施方案中，本专利技术提供了一种试剂盒，其包括：核酸构建体，其包含：编码包含配体结合位点的至少一个化学活化蛋白质结构域(cap)的核酸；以及编码肽的核酸；基因转移试剂和/或载体：以及结合至所述配体结合位点的配体。
7、在一些实施方案中，本专利技术提供了一种组合物，其包含：核酸构建体，其包含：编码包含配体结合位点的至少一个化学活化蛋白质结构域(cap)的核酸，其中所述配体是shield-1和/或aquashield-1；编码肽的核酸；以及基因转移试剂和/或载体。
8、在一些实施方案中，本专利技术提供了一种融合蛋白，其包含由编码包含配体结合位点的至少一个化学活化蛋白质结构域(cap)的核酸表达的蛋白质，其中所述配体是shield-1、雷帕霉素和/或aquashield-1；以及由核酸表达的肽，其中所述肽由shield-1、雷帕霉素和/或aquashield-1调控。
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1.一种调控肽的活性的方法，其包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个CAP包含结合至所述肽的N-末端的CapN，和/或结合至所述肽的C-末端的CapC。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述施用所述核酸构建体包括所述核酸构建体的直接注射、大分子介导的脂质体和/或生物聚合物基因递送、质粒递送、和/或病毒递送。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述病毒递送选自由以下各项组成的组：腺相关病毒(AAV)递送、腺病毒递送、慢病毒递送、痘苗病毒递送和逆转录病毒递送。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸构建体被稳定表达或瞬时表达。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述表达是细胞内表达或细胞外表达。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述配体结合位点包含FKBP结合结构域。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述肽是SsrA、核定位信号肽(NLS)、核输出信号肽、甲硫氨酸-脑啡肽或TEV蛋白酶切割位点。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述肽是酶活化肽、酶抑制肽、酶调控肽、结合肽、定位
10.如权利要求1所述的方法，其中所述配体是shield-1和/或aquashield-1。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述施用是肠胃外施用和/或非肠胃外施用。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个细胞是体外细胞或体内细胞。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述体内细胞是神经元细胞或肝细胞。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸构建体包含编码选自由以下各项组成的组的至少一种核酸：Aga2p、报告基因、TetR DBD、SspB、Vp16、P2A、接头、FLAG、UAS-mCherry和内部核糖体进入位点(IRES)。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸构建体还包含选自由以下各项组成的组的启动子核酸：CMV、CAG和突触蛋白。
16.如权利要求1所述的方法，其包括目的蛋白质(POI)。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述POI是转录因子、激酶、基因编辑酶或标记。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述POI是进化的绿色荧光蛋白(EGFP)。
19.如权利要求1所述的方法，其还包括测量所述肽的所述活性，其中所述测量包括测量所述肽的定位、结构和/或功能。
20.一种试剂盒，其包含：
21.如权利要求20所述的试剂盒，其包括一种或多种对照配体。
22.一种组合物，其包含：
23.一种融合蛋白，其包含
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种调控肽的活性的方法，其包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个cap包含结合至所述肽的n-末端的capn，和/或结合至所述肽的c-末端的capc。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述施用所述核酸构建体包括所述核酸构建体的直接注射、大分子介导的脂质体和/或生物聚合物基因递送、质粒递送、和/或病毒递送。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述病毒递送选自由以下各项组成的组：腺相关病毒(aav)递送、腺病毒递送、慢病毒递送、痘苗病毒递送和逆转录病毒递送。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸构建体被稳定表达或瞬时表达。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述表达是细胞内表达或细胞外表达。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述配体结合位点包含fkbp结合结构域。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述肽是ssra、核定位信号肽(nls)、核输出信号肽、甲硫氨酸-脑啡肽或tev蛋白酶切割位点。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述肽是酶活化肽、酶抑制肽、酶调控肽、结合肽、定位肽或降解肽。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述配体是shield-1和/或aquashield-1。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述施...
【专利技术属性】
技术研发人员：王文静，李鹏，沈佳琪，耿乐群，
申请(专利权)人：密歇根大学董事会，
类型：发明
国别省市：
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