【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物催化，具体涉及一种用于合成l-肌肽的氨肽酶及其应用。
技术介绍
1、l-肌肽又名β-丙氨酰-l-组氨酸，是由β-丙氨酸和l-组氨酸两种氨基酸缩合得到的二肽，是生物体内存在的一种天然抗氧化剂。肌肽作为一种天然二肽，在哺乳动物的肌肉和脑中大量存在。在生物体内，肌肽具有ph缓冲，抗氧化、抗自由基以及抗衰老等作用。在临床上，应用于减轻视觉疲劳、治疗白内障；含锌肌肽可用于治疗胃溃疡。与其他抗氧化剂相比，l-肌肽具有抗氧化能力强、无毒副作用的优点，并有多种生理活性，在医药、保健、卫生、美容等领域有广泛的应用前景。
2、l-肌肽的生产有多种方法。由于肌肽在动物肌肉中含量较高，早期直接从动物组织中进行肌肽的提取，这种方式产量低，纯度差，早已被淘汰。传统的化学合成法中，要对l-组氨酸和β-丙氨酸的活性基团分别进行活化和保护，并在随后的缩合反应之后消除保护基团，这种方法虽收率高，但整个合成过程反应步骤多，并且需要水合肼等剧毒制剂，而产品l-肌肽中不允许有肼的残留，因此对产品的提取、精制有很高的要求。已有多种酶法合成方法报道，包括二肽水解酶催化的β-丙氨酸和l-组氨酸的逆水解合成、氨肽酶催化的β-丙氨酰胺/丙氨酸酯与l-组氨酸之间的酰基转移反应合成以及肌肽合成酶催化的atp供能的β-丙氨酸与l-组氨酸缩合反应合成。其中二肽水解酶催化的反应受反应平衡的限制，需要投加高浓度β-丙氨酸进行反应，l-组氨酸的转化率最高仅有30%左右。而肌肽合成酶催化的反应依赖atp，存在成本问题。与上述这两类酶促反应相比，氨肽酶催化反应不需要投
3、尽管如此，目前报道的氨肽酶活性低，副产物多，产物分离纯化复杂，严重限制了该方法的实际应用，因此有必要开发具有高活性和高选择性的氨肽酶。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是现有技术缺少能够用于酶法合成l-肌肽的具有高活性和高选择性的氨肽酶，提供了一种用于合成l-肌肽的氨肽酶及其应用。本专利技术的氨肽酶可在β-丙氨酸甲酯存在下，高选择性催化l-组氨酸合成l-肌肽，并具有较高的酶活，具有工业化应用的价值。
2、为了筛选酶活力高、催化l-组氨酸合成肌肽的氨肽酶，专利技术人通过文献检索以及数据库检索分析，针对大量的微生物来源进行了筛选，并通过利用实验室已积累的多种氨肽酶资源进行实验比较，选出了来源于stictis urceolatum的氨肽酶，将其命名为s1，其氨基酸序列为：
3、mtssslpstprqrvrealptvylgryatgsknsltdvpgvlvstqsihespnypnaapdaintgvttilprknwfrkacfagifrlngtgemtgshfidetgllhtpiiitgtfgvgsalngvyeyairehsddkgkvnwgilpvvaetsdgflhdftkfavtpqhvvrgideassdsvregntgggtgmichqfkggtgsssrmvpadggktytigalvqanygamrdfkisgaptgrliceeqepkmqedpndpelfaqsstvfnppqeddnkdgsiivilgtdaplhpaqlrrlakratvglsrvggwgsnlsgdiflafstsneldvhaattankkvdpwlpqeatiqmiddqtinalleasadvveeailnavfmaetmegngnkvdaldlgkvkklmeky（seq id no: 1）
4、野生型氨肽酶s1的缺点在于酶活性低、副反应多，在催化l-组氨酸转化时，除了合成肌肽，还催化肌肽继续反应生成杂质，导致肌肽产率降低。
5、为了解决该问题，专利技术人尝试对野生型氨肽酶s1进行改造，提高酶活，使得l-组氨酸与β-丙氨酸甲酯活性提高。通过同源建模，构建了s1的同源模型，包括计算机模拟的蛋白3d模型，并和底物肌肽进行了分子对接，结合生物信息学分析，确定了活性口袋中的热点氨基酸以及一些可能存在相互作用的氨基酸位点。通过理性分析及半理性设计，利用定向进化的手段，对这些氨基酸位点进行定点突变构建突变体库。筛选出一种r85t/q194v突变体，本文中命名为m2，其氨基酸序列为seq id no: 3，催化合成肌肽的活性明显高于野生型。
6、随后，专利技术人还尝试继续改造突变体m2，以期望降低其催化肌肽和β-丙氨酸甲酯合成杂质的酶活力、同时保持其催化合成肌肽的酶活力，从而有利于工业化生产肌肽。例如，对第150位进行氨基酸替换。其中使用组氨酸(h或his)替换原有的丝氨酸(s或ser)，得到相对于野生酶s1的(r85t、s150h、q194v、i319e)突变体，其大大降低了m2催化肌肽合成杂质的活性，其催化l-组氨酸转化时的产物中肌肽达80%以上，杂质生成减少，将该r85t/s150h/q194v/i319e突变体命名m4，其氨基酸序列为seq id no: 5，在肌肽的工业化生产中具有应用价值。
7、在此基础上，专利技术人完成了本专利技术。
8、本专利技术通过以下技术方案解决上述技术问题。
9、本专利技术的第一方面提供一种氨肽酶，所述氨肽酶的氨基酸序列如seq id no: 3或5所示。
10、本专利技术的第二方面提供一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如第一方面所述的氨肽酶。
11、在一些实施方案中，所述多核苷酸的序列如seq id no: 4或6所示。
12、众所周知，同样一种核苷酸序列，在不同的微生物宿主中的表达结果往往有很大差异。为了在基因工程中最常用的大肠杆菌中高效表达氨肽酶，可以对这些酶的表达基因进行密码子优化。
13、密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择通常表现出对于编码相同氨基酸的一些密码子的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组trna库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化密码子的dna序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。
14、例如，为了在大肠杆菌中表达氨肽酶及其突变体m4，经密码子优化的野生型氨肽酶seq id no: 1的编码基因可以是seq id no: 2；氨肽酶突变体m4 seq id no: 3的编码基因可以是seq id no: 4。
15、本专利技术的第三方面提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含如第二方面所述的多核苷酸。
16、本专利技术的第四方面提供一种转化体，所述转化体表达如第一方面所述的氨肽酶，或者包含如第二方面所述的多核苷酸，或者包含如第三方面所述的重组表达载体；所述转化体不为动物品种或植物品种。
17、在一些实施方案中，所述转化体为真核细胞或原核细胞。
18、在一些实施方案中，所述真核细胞选自毕赤酵本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种氨肽酶，其特征在于，所述氨肽酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3或5所示。
2.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的氨肽酶。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO: 4或6所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求2或3所述的多核苷酸。
5.一种转化体，其特征在于，所述转化体表达如权利要求1所述的氨肽酶，或者包含如权利要求2或3所述的多核苷酸，或者包含如权利要求4所述的重组表达载体；所述转化体不为动物品种或植物品种。
6.如权利要求5所述的转化体，其特征在于，所述转化体为真核细胞或原核细胞。
7.如权利要求6所述的转化体，其特征在于，所述真核细胞选自毕赤酵母和酿酒酵母；所述原核细胞选自枯草芽孢杆菌和大肠杆菌。
8.如权利要求7所述的转化体，其特征在于，所述大肠杆菌为E .coli BL21(DE3)。
9.如权利要求1所述的氨肽酶、如权利要求2或3所述的多核苷酸、如权利要求4
10.一种制备氨肽酶的方法，其特征在于，所述方法包括：
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述转化体中，编码所述氨肽酶的多核苷酸为体外合成或在原多核苷酸上突变获得。
12.一种制备L-肌肽的方法，其特征在于，所述方法包括在β-丙氨酸甲酯存在下，通过如权利要求1所述的氨肽酶催化L-组氨酸进行酰基转移反应；
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述氨肽酶的使用形式选自纯酶、粗酶液、包含所述氨肽酶的发酵液、酶粉和固定化酶。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述粗酶液通过如下方法制备：对表达所述氨肽酶的静息细胞在缓冲液中进行冰浴超声破碎，高速离心后取上清即得。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为PBS缓冲液。
16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述粗酶液的体积比为10-12%。
...【技术特征摘要】
1.一种氨肽酶，其特征在于，所述氨肽酶的氨基酸序列如seq id no: 3或5所示。
2.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的氨肽酶。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如seq id no: 4或6所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求2或3所述的多核苷酸。
5.一种转化体，其特征在于，所述转化体表达如权利要求1所述的氨肽酶，或者包含如权利要求2或3所述的多核苷酸，或者包含如权利要求4所述的重组表达载体；所述转化体不为动物品种或植物品种。
6.如权利要求5所述的转化体，其特征在于，所述转化体为真核细胞或原核细胞。
7.如权利要求6所述的转化体，其特征在于，所述真核细胞选自毕赤酵母和酿酒酵母；所述原核细胞选自枯草芽孢杆菌和大肠杆菌。
8.如权利要求7所述的转化体，其特征在于，所述大肠杆菌为e .coli bl21(de3)。
9.如权利要求1所述的氨肽酶、如...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨建花，李佳成，卞雨花，吴锋，王勇，喻红忠，
申请(专利权)人：上海昱菘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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