【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，具体涉及碱性果胶酶突变体及编码基因和应用。
技术介绍
1、在传统的棉麻精炼工艺中，一般使用高浓度的强碱溶液处理退浆后的棉麻织物，除去植物表面的非纤维成分。在这个过程中，不仅会损伤棉麻的纤维成分，影响下游产品的品质，而且工艺过程中引入大量的化学成分，增加了废水的处理难度和产品的生产成本。
2、碱性果胶酶一般指果胶酸裂解酶，可通过反式消去作用，来断裂聚半乳糖醛酸链的α-1，4糖苷键，并在非还原端生成4，5-不饱和低聚糖半乳糖醛酸盐。碱性果胶酶的最适反应ph在8.0-10.0，在碱性条件下，作为棉纤维主体的纤维素有润胀的趋向，而碱性果胶酶利用其专一性，有效分解去除在棉纤维表面，对棉蜡等疏水性共生物起黏结作用的果胶质，使疏水性物质从棉纤维表面脱落，从而达到精练效果，而纤维本身不受到损伤。
3、酶法脱胶工艺一般在较高的温度（50-60℃）下进行，而脱胶过程一般持续4-8h。然而，目前常用的碱性果胶酶产品，当温度上升到45℃以上时，果胶酶的酶活会随着温度的升高急剧下降。
4、实际的生产工艺条件下，也要求碱性果胶酶具有良好的ph稳定性。细菌来源的碱性果胶酶一般报道在其最适反应ph范围前后较小的范围内具有相对好的稳定性，但酶保持稳定酶活的时间相对较短。
5、自1972年首次发现碱性果胶酶以来，对碱性果胶酶的异源表达和应用逐渐成为研究热点。目前表达碱性果胶酶的宿主主要包括大肠杆菌、毕赤酵母和枯草芽孢杆菌。其中，毕赤酵母营养需求低、增殖速率高、菌体密度大，且毕赤酵母表达蛋白易于
6、寻找可以在较宽ph范围稳定的碱性果胶酶，以及在可以在较长时间内保持热稳定的碱性果胶酶，对于扩展碱性果胶酶在工业中的实际应用具有重要的意义。因此，现阶段碱性果胶酶的工业化应用亟待解决的问题，包括但不限于以下几点：1.耐高温；2.耐酸碱；3.发酵酶活水平高。
技术实现思路
1、本专利技术的主要目的是提供一种碱性果胶酶突变体及其基因、及含有该基因的重组表达载体和重组菌株、及该重组菌制备碱性果胶酶的方法，旨在解决现有技术中碱性果胶酶耐酸碱耐热性差、发酵酶活水平低的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供的技术方案之一，是一种碱性果胶酶突变体，所述突变体是将seq id no.1所示野生型碱性果胶酶氨基酸序列中第10、113、251、328位点的t、l、w、d，分别突变为i、p、s、e获得的，所述突变体的氨基酸序列如序列表seq id no.3所示。
3、本专利技术还提供上述碱性果胶酶突变体的编码基因；
4、进一步地，所述碱性果胶酶突变体的编码基因，核苷酸序列如序列表seq id no.4所示。
5、进一步地，在酵母菌中异源表达的碱性果胶酶突变体的编码基因，核苷酸序列如序列表seq id no.5所示。
6、本专利技术提供的技术方案之二，是技术方案之一所述碱性果胶酶突变体的应用，特别是在水解聚半乳糖醛酸链的α-1，4糖苷键中的应用，更特别地是在纺织工业中的应用，如在碱性环境下对棉纤维表面果胶质降解中的应用。
7、本专利技术提供的技术方案之三，是包含上述碱性果胶酶突变编码基因的重组载体或重组菌株；
8、优选地，所述重组载体所采用的表达质粒为ppiczαa；
9、优选的，所述重组菌株采用的宿主细胞为毕赤酵母x33。
10、本专利技术提供的技术方案之四，是技术方案之三所述重组表达载体或重组菌株的应用，特别是在制备技术方案一所述碱性果胶酶突变体中的应用；
11、进一步地，采用上述重组菌株制备碱性果胶酶突变体的方法如下：
12、发酵罐中的培养：按照发酵罐培养基体积的6-8%（v/v）进行接种，培养温度28.5-30.5℃，罐压0.05-0.09mpa，初始转速100rpm，初始风量200m3/h，最高转速600rpm，最高通风量4000m3/h；
13、补料的控制：当发酵至菌体湿重达到80-95g/l时，开始流加40-45%的甘油，流加速度为610-730kg/h，当菌体湿重达到170-180g/l时，停止流加甘油，饥饿处理0.5-1.0h，然后开始流加甲醇，前0.5-1.5h，流加甲醇的流速为80-100kg/h，0.5-1.5h后，甲醇的流加速度每小时增加25-45kg，直至达到最大补料速率为320-360kg/h，保持该补料速度直至发酵结束；
14、溶氧的控制：开始流加甲醇前，通过调节转速和风量控制溶氧达到33-42%，开始流加甲醇后，控制溶氧10%-20%，达到最高转速和通风量后，溶氧不再控制；
15、补氨控制ph在5.5-5.7；
16、菌体自溶严重时结束发酵，培养周期190-210h。
17、进一步地，种子罐中培养条件为：6-9%（v/v）接种量，温度29-30℃，罐压0.04-0.08mpa，初始转速100rpm，初始风量25m3/h，通过加转速和风量控制溶氧大于35%，最高转速600rpm，最高通风量200m3/h，补氨控制ph在5.5-5.7，培养49-55h；
18、进一步地，种子培养基组成为（w/v）：甘油4-6%，磷酸一铵3-5.2%，磷酸氢二钠0.18-0.35%，硫酸镁2.1-2.7%，硫酸钾1.1-1.5%，硫酸钙0.2-0.35%，氢氧化钾0.18-0.29%，磷酸0.03-0.06%，其余为水，ph在5.5-5.7；
19、进一步地，发酵培养基组成为（w/v）：甘油4.5-5.6%，磷酸一铵5.6-6.7%，磷酸氢二钠0.35-0.57%，硫酸镁1.5-2.5%，硫酸钾1.9-2.6%，硫酸钙0.18-0.34%，氢氧化钾0.18-0.25%，磷酸0.05-0.18%，其余为水，ph在5.5-5.7。
20、有益效果：
21、本专利技术提供的碱性果胶酶突变体，最适反应ph为9.4，在ph5.5-10.0的条件下，室温静置24h后，相对酶活力仍然保持在95%以上，最适反应温度为60℃，在ph8.0的条件下，60℃以下保温4h，仍能保留90%以上的酶活。
22、本专利技术提供的密码子优化后的碱性果胶酶突变基因，通过表达质粒ppiczαa在毕赤酵母x33中进行表达，在60m3发酵罐中的平均发酵酶活力为5216u/ml，酶活水平比突变前提高了1.8倍以上，能进一步降低碱性果胶酶的生产成本，促进碱性果胶酶在纺织工业脱胶方面的广泛应用。
23、此外，本专利技术确认了碱性果胶酶中与耐酸碱、耐热性能相关的4个氨基酸位点，并证明了这些位点对于该酶耐酸碱、耐热性能的重要性，对于研究碱性果胶酶的耐酸碱、耐热性能提供了重要的线索，同时对于其它碱性果胶酶的研究提供了可靠的参考依据本文档来自技高网...
【技术保护点】
1. 一种碱性果胶酶突变体，其特征在于，所述碱性果胶酶突变体氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
2.权利要求1所述碱性果胶酶突变体的编码基因。
3. 如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.4或SEQ ID NO.5所示。
4.包含权利要求2所述编码基因的重组载体或重组菌株。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，采用的表达质粒为pPICZαA。
6.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，采用的宿主菌为毕赤酵母X33。
7.权利要求4所述重组载体或重组菌株在生产权利要求1所述碱性果胶酶突变体中的应用。
8.权利要求1所述碱性果胶酶突变体在水解聚半乳糖醛酸中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，是在纺织工业酶法脱胶工艺中的应用。
【技术特征摘要】
1. 一种碱性果胶酶突变体，其特征在于，所述碱性果胶酶突变体氨基酸序列如seq idno.3所示。
2.权利要求1所述碱性果胶酶突变体的编码基因。
3. 如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如seq idno.4或seq id no.5所示。
4.包含权利要求2所述编码基因的重组载体或重组菌株。
5.如权利要求4所述的重组...
【专利技术属性】
技术研发人员：佟新伟，闫宜江，腾来宾，王金余，徐子淇，张洪智，
申请(专利权)人：山东隆科特酶制剂有限公司，
类型：发明
国别省市：
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