【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于sul1、sul2、sul3的光驱动扩增-光热分析的方法及装置，属于分析检测。
技术介绍
1、抗生素抗性基因是编码一系列蛋白质或其他分子机制，使细菌能够对抗生素产生耐药性的基因，其存在和传播对公共健康、食品安全和环境安全构成了严重威胁。其中，磺胺类抗生素抗性基因是细菌等微生物在面临磺胺类抗生素压力时，通过基因突变或水平基因转移等方式获得的，能够赋予细菌对磺胺类抗生素产生抗性的基因。随磺胺类抗生素广泛使用，其残留物在环境中普遍存在，经食物链传递，导致细菌及人体内的致病菌对磺胺类抗生素产生抗性，严重威胁人体健康。因此，为了应对磺胺类抗性基因带来的挑战，迫切需要开发磺胺类抗生素抗性基因的现场快速检测方法。
2、抗生素抗性基因的检测方法主要基于核酸扩增，包括聚合酶链式反应(pcr)以及等温扩增技术。因pcr扩增时间长且依赖于专业人员及设备，并不适用于现场快速检测。环介导等温扩增即lamp技术能够在等温(通常是60℃～65℃)条件下，利用链置换dna聚合酶(如bst dna聚合酶)和一套特异引物，通过自循环的链置换dna合成完成目标核酸的快速扩增。lamp技术针对靶基因的6个特定区域设计4种特异引物，这4种引物分别为fip(正向内引物)、bip(反向内引物)、f3(正向外引物)和b3(反向外引物)。这些引物在扩增反应中起着关键作用，能够确保扩增的特异性和高效性。
3、lamp的扩增过程主要分为两个阶段：
4、(1)起始阶段：在此阶段，内引物和外引物均参与反应，它们与目标dna的特定
5、(2)循环扩增阶段：进入此阶段后，只有内引物参与反应，内引物通过链置换dna合成反应，不断产生新的茎环结构dna产物，这些产物又可以作为模板继续参与反应，从而实现靶序列的指数扩增。
6、光驱动扩增，通过将各种光激活剂加入扩增体系中，用发光二极管(led)或激光等作为光源，光激活剂均匀分散于扩增体系，经led激发，为核酸扩增提供能量供应。chen等人建立了一种聚吡咯包覆氧化铁粒子介导的光驱动lamp，可在约1小时内检测大肠杆菌中低至8cfu的malb基因(biosensors and bioelectronics 2022,215,114574)。
7、目前尚未有利用光驱动扩增技术实现多个基因同时lamp扩增的报道。使用光激活剂介导、光驱动lamp的挑战在于需要具有更高活性的光激活剂，操作难点在于光激活剂需要与lamp体系兼容且不干扰反应；需有可精确控制的光源和光驱动条件以避免影响扩增稳定性；需开发高灵敏度、高特异性的检测方法。
8、外同轴反射led光源与其他led光源在多个方面存在显著的区别，主要体现在结构设计、光线特性、应用场景以及光学效率上。外同轴反射led光源主要由侧向光源和分光镜组成，光源发出的光线首先经过分光镜，然后被平行反射至待测物上。其他led光源如环形光源、条形光源、线型光源等，它们的结构设计各不相同，但通常不包含分光镜这一组件。例如，环形光源直接照射被测物体上方，条形光源则提供直射、斜射及测光等多种照射效果。外同轴反射led光源由于采用了分光镜设计，光线经过分光镜后能够均匀照射在物体表面，减少阴影和反射造成的干扰。同时，这种光源通常具有较高的亮度和均匀性，能够突出物体的外形轮廓特征。其他led光源虽然也具备各自的光线特性，如环形光源能够解决对角照射阴影问题，条形光源照射角度与安装随意可调等，但相比之下，外同轴反射led光源在光线均匀性和减少阴影方面更具优势。外同轴反射led光源分光镜设计减少光损失，从而提高光学效率。
9、目前尚未有利用外同轴反射led光源激发-光驱动多重lamp扩增结合光热试纸技术同时检测磺胺类基因的相关报道。
技术实现思路
1、技术问题：现有光驱动扩增光激活剂的效率不理想；光驱动扩增技术尚未应用于同时扩增多个抗性基因；外同轴反射led光源虽具有光线均匀性和减少阴影的优势，但尚未与光驱动扩增及光热试纸技术结合用于检测磺胺类抗性基因。使用光激活剂介导、光驱动lamp的挑战与操作难点在于光激活剂需与lamp体系兼容且不干扰反应；需有可精确控制的光源和光驱动扩增条件以避免影响扩增稳定性；需开发高灵敏度、高特异性的检测方法。
2、专利技术目的：为了克服上述的现有技术的不足与缺陷，本专利技术提供一种用于sul1、sul2、sul3的光驱动扩增-光热分析的方法及装置，采用光激活剂sb2moo6@nifes2作为光热材料，利用其光致活性产生光电子和光热效应，在808nm外同轴反射led光源照射下，实现快速控温且与lamp扩增体系在分子层面直接接触，光热效率显著提高，然后再进行光热试纸显色检测，从而实现光驱动扩增和光热侧流层析试纸检测两个环节的集约化高效扩增及检测。
3、技术方案：本专利技术采用以下技术方案。
4、本专利技术的第一个目的是，提供一种利用光激活剂sb2moo6@nifes2及光热侧流层析试纸实现抗性基因sul1、sul2和sul3光驱动lamp及检测的方法。该方法包括光驱动扩增和光热侧流层析试纸检测两个环节。首先，利用808nm外同轴反射led光源照射光驱动扩增体系，激发光驱动扩增体系中的光激活剂sb2moo6@nifes2产生光电子和热，为lamp提供能量，使sul1、sul2和sul3作为模板引发扩增反应，获得大量双链dna扩增产物；以三种核酸链修饰光激活剂sb2moo6@nifes2得到三种光热信号探针，并分别在光热侧流层析试纸的检测区和质控区固定t探针和c探针，得到针对目标基因sul1、sul2、sul3的光驱动lamp产物的多靶标光热侧流层析试纸；然后，通过光热侧流层析试纸以夹心形式捕获扩增产物和信号探针，给出与扩增产物含量正相关的光热温变信号，实现目的基因的定量检测。所述lamp等温扩增体系包括以下组分：引物组、光激活剂sb2moo6@nifes2、dna模板、bst3.0 dna聚合酶以及等温扩增缓冲液。
5、使用光激活剂介导、光驱动lamp的挑战在于需要具有更高活性的光激活剂，操作难点在于光激活剂需要与lamp体系兼容且不干扰反应；需有可精确控制的光源和光驱动条件以避免影响扩增稳定性；需开发高灵敏度、高特异性的检测方法。
6、具体的，本专利技术一种用于sul1、sul2、sul3的光驱动扩增-光热分析的方法，包括以下步骤：
7、s1、制备光激活剂sb2moo6@nifes2
8、s2、光驱动扩增
9、在光激活剂sb2moo6@nifes2介导下，使用808nm外同轴反射led光源的照射，待测样品经光驱动环介导等温扩增即光驱动lamp等温扩增体系进行扩增反应，得到扩增产物，其中，
10、所述lamp等温扩增体系包括以下组分：引物组、光激活剂sb2moo6@nifes2、dna模板、bst3.本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于sul1、sul2、sul3的光驱动扩增-光热分析的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述808nm外同轴反射LED光源的照射参数为功率4.5-6W，照射时间10-30min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光激活剂Sb2MoO6@NiFeS2的制备方法包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述硝酸镍溶解于水中的浓度为0.4-0.5mM。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述Sb2MoO6溶解于水中的浓度为0.1-0.25mM。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述离心包括，在10000-12000rpm离心10-15min；
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述LAMP等温扩增体系中，每组DNA模板的浓度为4％-8％v/v；
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，光热信号探针独立于试纸主体使用，或者滴加并干燥在结合垫上并将结合垫整合
9.一种用于sul1、sul2、sul3的光驱动扩增-光热分析的装置，其特征在于，包括808nm外同轴反射LED光源、光驱动扩增装置及光热侧流层析试纸组件(9)，其中，
10.根据权利要求9所述的装置，其特征在于，所述808nm外同轴反射LED光源包括LED光源(7)、分光镜(11)及平凸柱透镜(10)，所述平凸柱透镜(10)竖直设置于所述避光保温外壳(3)内部，其平面一侧朝前，所述LED光源(7)水平置于所述平凸柱透镜(10)后侧底部位置，所述分光镜(11)呈45°倾斜设置于所述平凸柱透镜(10)与所述LED光源(7)之间，LED光源(7)经过分光镜(11)及平凸柱透镜(10)后聚集为线性光斑，构成外同轴反射LED光源(13)；
...【技术特征摘要】
1.一种用于sul1、sul2、sul3的光驱动扩增-光热分析的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述808nm外同轴反射led光源的照射参数为功率4.5-6w，照射时间10-30min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光激活剂sb2moo6@nifes2的制备方法包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述硝酸镍溶解于水中的浓度为0.4-0.5mm。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述sb2moo6溶解于水中的浓度为0.1-0.25mm。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述离心包括，在10000-12000rpm离心10-15min；
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述lamp等温扩增体系中，每组d...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨艺楠，张云涛，史学丽，高玉娥，张毅，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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