【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物材料领域，具体是指负载m2巨噬细胞外泌体的mmp-9响应性水凝胶及其制备方法和应用。
技术介绍
1、随着糖尿病患者数量的急剧增加，慢性不愈合创面也越来越多，已经成为临床上亟待解决的棘手问题。慢性糖尿病创面通常停在炎症阶段，其特征是微环境紊乱、长期炎症状态、修复细胞功能受损。因此，及时终止炎症以确保正常有序的修复过程至关重要。巨噬细胞m1-m2表型转换失调，导致m1巨噬细胞过度积聚，是糖尿病创面慢性炎症的主要病理特征。然而，近年来针对巨噬细胞的策略通常侧重于增强m2巨噬细胞的活性或添加外源m2巨噬细胞，而忽略了已经大量积聚的m1巨噬细胞的存在。
2、外泌体是小的细胞外囊泡，在细胞间的通信中起重要作用。研究表明，来自成纤维细胞、内皮细胞和脂肪间充质干细胞的外泌体可以诱导巨噬细胞从m1向m2表型转换，从而减少炎症，促进糖尿病创面愈合。此外，外泌体可以从它们的供体细胞获得生物分子，并被赋予与其亲本细胞相同的生物学功能。例如，m2衍生外泌体在炎性疾病中表现出与m2巨噬细胞相似的抗炎特性。基于此，我们提出应用m2-exos来调节慢性糖尿病创面炎症反应的策略。然而，外泌体的应用仍面临着半衰期短、不稳定等挑战。
3、为了解决这些障碍，一些包括水凝胶在内的生物材料被用于外泌体的负载及连续释放。但这些材料对外泌体释放往往不能精准控制，其作用与创面微环境的变化不匹配。因此，为了达到最佳的治疗效果，有必要开发微环境响应性的外泌体递送系统。
技术实现思路
1、本专利
2、为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案为负载m2巨噬细胞外泌体的mmp-9响应性水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
3、s1.m2巨噬细胞来源外泌体的提取，具体为：选择外泌体细胞，诱导为m2巨噬细胞，提取外泌体溶液；
4、s2.中间溶液配置，具体为：
5、s201.合成氧化葡聚糖(od)；
6、s202.分别选用氧化葡聚糖(od)、羧甲基壳聚糖(cmc)与pro-val-gly-leu-iso-gly(pg-6)，并分别配制od、cmc和pg-6溶液，备用；
7、s3.制作负载m2巨噬细胞衍生外泌体的mmp-9响应性水凝胶，具体内容为：
8、s301.配置响应肽与m2型巨噬细胞外泌体的混合液；
9、s302.将od溶液与响应肽与外泌体的混合液混合后，再与cmc溶液混合，得到负载m2巨噬细胞衍生外泌体的mmp-9响应性水凝胶。
10、进一步地，所述步骤s1中m2巨噬细胞来源外泌体的提取，包括以下步骤：
11、s101.选取raw264.7细胞作为外泌体细胞来源，所述raw264.7细胞经传代培养后，筛选出状态良好的细胞，添加白细胞介素(il-4)诱导得到m2巨噬细胞；
12、s102.鉴定m2型巨噬细胞表型，确认成功得到m2型巨噬细胞后，使用含无外泌体血清的培养基连续培养24小时，去除细胞碎片等杂质，收集细胞培养上清液；
13、s103.取用s102所得细胞培养上清液，控制离心加速度为10,000×g，温度为4℃，离心10min，转移至新的离心管中；
14、s104.将瓶装磁珠，震荡混匀(vortex)30s，取350μl加入到离心管中，控制离心加速度3,000×g，4℃离心2min，弃上清；
15、s105.加入10ml，4℃预冷且经过0.22μm过滤的磷酸盐缓冲溶液(pbs)，振荡混匀30s，控制离心加速度3,000×g，4℃离心5min，弃上清；
16、s106.取用并加入4ml bufferexa，1mlbuffer exb和14.65ml上清，置旋转混合仪中，4℃旋转混合40min；
17、s107.取下离心管，置于磁力架，4℃静置10min，待磁珠聚集，弃上清；
18、s108.对s107留存物体，控制离心加速度3,000×g，4℃离心1min，弃残液；
19、s109.加入0.5ml bufferexe混匀，控制离心加速度7,000×g，4℃离心2min，将上清转移至ep管中；
20、s110.用exe润洗针式过滤器a和b后分别过滤外泌体溶液，得到纯化外泌体溶液，冻存，备用。
21、进一步地，所述步骤s2为中间溶液配制，包括以下步骤：
22、s201.合成氧化葡聚糖(od)，具体包括：
23、①将5g右旋糖酐溶解于250ml蒸馏水中，可得dex溶液；
24、②将naio4溶于5ml蒸馏水中，然后逐滴添加到dex溶液中，然后在室温下在黑暗中将混合物搅拌3.5h；
25、③将3ml乙二醇添加到混合物中以使未反应的naio4反应，将混合物再搅拌1h。将所得产物针对蒸馏水(mwco 1400da)透析3天并冻干，以获得合成氧化葡聚糖(od)；
26、s202.分别选用氧化葡聚糖(od)、羧甲基壳聚糖(cmc)与pro-val-gly-leu-iso-gly(pg-6)，用ph＝7.4的磷酸盐缓冲溶液(pbs)分别配置质量分数为5％的od溶液、质量分数为3％的cmc溶液，及浓度为20mg/ml的pg-6溶液，具体步骤为：
27、(1)配置10ml质量分数为5％的od，即在含有500mg od的棕色瓶中加入10ml pbs溶液，超声/振荡溶解即得；
28、(2)配置10ml质量分数为3％的cmc，即在含有300mg cmc的棕色瓶中加入10mlpbs溶液，超声/振荡溶解即得；
29、(3)配置5ml浓度为20mg/ml的响应肽，即在含有100mg响应肽的棕色瓶中加入5mlpbs溶液，振荡溶解即得。
30、进一步地，所述步骤s202中od溶液配置温度为20-25℃，所述cmc溶液配制温度为45-60℃。
31、进一步地，所述步骤s3为制作负载m2巨噬细胞衍生外泌体的mmp-9响应性水凝胶，具体内容为：
32、s301.配置响应肽与m2型巨噬细胞外泌体的混合液
33、在含有24mg响应肽的棕色瓶中加入0.7mlpbs溶液和0.5ml浓度为3×1010particles/ml的m2型巨噬细胞外泌体溶液，振荡溶解，可得配置1.2ml响应肽与m2型巨噬细胞外泌体的混合液；
34、s302.负载m2巨噬细胞衍生外泌体的mmp-9响应性水凝胶制备
35、取300μl 5％od溶液，将其和s201所得混合液混合均匀后，再与1.5ml 3％cmc溶液混合均匀，在常温下即可交联得到3ml负载m2巨噬细胞衍生外泌体的mmp-9响应性水凝胶，其中每毫升水凝胶中负载外泌体5×109particles。
36、进一步地，所述步骤s301中响本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.负载M2巨噬细胞外泌体的MMP-9响应性水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中M2巨噬细胞来源外泌体的提取，包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2为中间溶液配制，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S202中OD溶液配置温度为20-25℃，所述CMC溶液配制温度为45-60℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3为制作负载M2巨噬细胞衍生外泌体的MMP-9响应性水凝胶，具体内容为：
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S301中响应肽与M2型巨噬细胞外泌体的混合液，其含有外泌体1.5×1010particles，响应肽浓度为20mg/mL。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的制备方法制得的负载M2巨噬细胞外泌体的MMP-9响应性水凝胶。
8.根据权利要求7所述的负载M2巨噬细胞外泌体的MMP-9响应性水凝胶在调控糖
...【技术特征摘要】
1.负载m2巨噬细胞外泌体的mmp-9响应性水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中m2巨噬细胞来源外泌体的提取，包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s2为中间溶液配制，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s202中od溶液配置温度为20-25℃，所述cmc溶液配制温度为45-60℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步...
【专利技术属性】
技术研发人员：张翠萍，孟浩，马丽千，沈齐，付小兵，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：
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