【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于化学及分析检测领域，具体涉及一种硫代亚硝酸近红外生物发光探针及其制备方法和应用。
技术介绍
1、硫代亚硝酸(thionitrous acid，hsno)作为最小分子的s-亚硝基硫醇，是接h2s和no信号通路的关键信号转导分子。hsno不但可以通过亚硝基化调控蛋白质功能，而且可将no、h2sn、hno等体内重要的信号转导分子“转运”至胞内，从而在心血管、神经、免疫系统发挥重要作用。
2、近年来，越来越多的研究表明，硫化氢可以抑制或激活nos的活性。no通过抑制或诱导胱硫醚-β-合酶和胱硫醚-γ-裂解酶的活性或表达，进而影响内源性h2s的生成。在细胞增殖和凋亡方面存在双相作用，这种双相作用与h2s/no的水平、作用时间、肿瘤细胞类型及敏感性等因素有关。在结肠癌中，h2s和no通过钟形浓度-反应曲线调节细胞增殖，较低水平的内源性h2s/no促进肿瘤细胞增殖，而暴露于较高水平外源性h2s/no时则显示出抗肿瘤活性。在结肠癌中h2s参与由外源性no介导的抗肿瘤迁移和侵袭活性，提示h2s与no之间存在cgmp/vasp信号通路介导的cross-talk。由此可见，h2s、no的表达以及它们之间的串扰影响着结肠癌的发展进程，hsno一方面是no的来源，又是h2s与no串扰的产物，其水平变化与结肠癌的发生与发展存在紧密联系，但具体机制尚不清楚。迫切需开发准确的hsno检测方法，这有助于更好地认识其生理作用，有助于研究结肠癌和hsno水平变化之间的关系。
3、现有的hsno检测方法包括傅里叶变换红外光谱、15
4、生物发光技术通过体内化学反应产生可测量的光信号，具有高灵敏度。此外，生物发光不依赖外部光源，从而避免了荧光检测中的背景噪音干扰，提供了更高的信噪比。该技术还具有非侵入性和实时监测的优势，适合用于活体水平实验。鉴于hsno在体内的浓度极低，传统检测方法难以提供足够的灵敏度和特异性。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是在现有技术的基础上，以阿卡鲁明(akalumine)荧光素类似物作为荧光素酶的识别底物，以含有邻苯二胺和2-氟-5硝基苯甲酸的结构片段作为hsno的特异性全新识别基团，合成了近红外生物发光探针bf-5，该生物发光探针bf-5具有良好的选择性、稳定性、生物相容性和较低的检测限(327nm)，能够检测出hct116-luc细胞中的生理水平hsno，可以应用于hct116-luc结肠癌裸鼠移植瘤中hsno的生物发光成像，为揭示hsno的生理病理机制提供了一种可视化的检测工具，对于研究与hsno相关的疾病(如癌症、心血管疾病和神经退行性疾病等)具有重要意义。
2、本专利技术的第二个目的是提供上述生物发光探针的制备方法。
3、本专利技术的第三个目的是提供上述生物发光探针在检测硫代亚硝酸中的应用。
4、本专利技术的技术方案如下：
5、一种硫代亚硝酸近红外生物发光探针，其发光探针的结构式如下所示：
6、
7、本专利技术提供的硫代亚硝酸近红外生物发光探针bf-5的设计思路：基于萤光素酶-萤光素生物发光成像的原理，以含有邻苯二胺和2-氟-5-硝基苯甲酸酯的结构片段作为hsno的特异性全新识别基团，以nir荧光素类似物(bl660)作为荧光素酶的识别底物，构建得到探针bf-5。
8、本专利技术提供的硫代亚硝酸近红外生物发光探针bf-5的识别机理：首先hsno的巯基与2-氟-5-硝基苯甲酸酯的-f发生反应后，发生分子内的环化反应脱掉对硝基苯并二硫酮，然后hsno中的n＝o与邻苯二胺反应，生成苯并三氮唑，最后苯并三氮唑水解脱去，释放出bf-4，继而被萤光素酶识别发生酶促反应，产生生物发光。将生物发光探针bf-5与hsno反应之后的产物进行了高分辨质谱验证，探针与hsno反应后，生成了化合物bf-4，证明了生物发光探针与hsno的反应机理。
9、硫代亚硝酸近红外生物发光探针的合成路线如下：
10、
11、
12、硫代亚硝酸近红外生物发光探针的制备方法，它包括如下步骤：
13、(1)在咪唑的存在下，对羟基苯甲醇和叔丁基二甲基氯硅烷进行化学反应，制备化合物b-1；
14、(2)在4-二甲氨基吡啶和edci的存在下，化合物b-1与2-氟-5-硝基苯甲酸进行化学反应，制备化合物b-2；
15、(3)化合物b-2和对甲苯磺酸进行化学反应，制备化合物b-3；
16、(4)化合物b-3、k2co3和三光气进行化学反应，得到中间体化合物，再与n-boc-1,2-亚苯基二胺和吡啶进行化学反应，制备化合物b-4；
17、(5)化合物b-4和三氟乙酸进行化学反应，制备化合物b-5；
18、(6)化合物a与4-膦酰丁烯酸三乙酯和氢化钠进行化学反应，制备化合物bf-1；
19、(7)将化合物bf-1在碱性溶液中进行水解反应，所得反应液再与酸性溶液中进行酸化，制备化合物bf-2；
20、(8)在4-二甲氨基吡啶和edci的存在下，化合物bf-2与s-三苯甲基-d-半胱氨酸甲酯进行化学反应，制备中间体化合物，再与三苯基氧膦和三氟甲烷磺酸酐进行化学反应，制备bf-3；
21、(9)将化合物bf-3在酸性溶液中进行水解反应，所得反应液再与碱性溶液中进行酸化，制备化合物bf-4；
22、(10)在hbtu和hobt的存在下，化合物bf-4与化合物b-5进行化学反应，所得反应液再与dipea进行化学反应，制备生物发光探针bf-5。
23、对于本专利技术而言，在步骤(1)中，对羟基苯甲醇和叔丁基二甲基氯硅烷的摩尔比为0.8-1.5:1，可以但不仅限于0.8:1、0.9:1、1.0:1、1.1:1、1.2:1、1.4:1或1.5:1，为了获得更好的效果，对羟基苯甲醇和叔丁基二甲基氯硅烷的摩尔比为1.0:1。
24、在步骤(1)中，反应温度为20-40℃，可以但不局限于20℃、25℃、30℃、35℃或40℃，优选地，反应温度为30℃。
25、对于本专利技术而言，在步骤(2)中，化合物b-1与2-氟-5-硝基苯甲酸的摩尔比为1:1.0-1.5，可以但不仅限于1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3或1:1.5，为了获得更好的效果，化合物b-1与2-氟-5-硝基苯甲酸的摩尔比为1:1.3。
26、在步骤(2)中，化合物b-1与4-二甲氨基吡啶的摩尔比为6.0-8.0:1，可以但不仅限于6.0:1、6.5:1、7.0:1、7.2:1、7.3:1、7.4:1、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种硫代亚硝酸近红外生物发光探针，其生物发光探针的结构式如下所示：
2.一种权利要求1所述的硫代亚硝酸近红外生物发光探针的制备方法，其特征在于，其合成路线如下：
3.根据权利要求2所述的硫代亚硝酸近红外生物发光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的硫代亚硝酸近红外生物发光探针的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，对羟基苯甲醇和叔丁基二甲基氯硅烷的摩尔比为0.8-1.5:1，优选为1:1.0；对羟基苯甲醇和咪唑的摩尔比为0.8-1.5:1，优选为1.0:1；反应温度为20-40℃，优选为30℃。
5.根据权利要求3所述的硫代亚硝酸近红外生物发光探针的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，化合物B-1与2-氟-5-硝基苯甲酸的摩尔比为1:1.0-1.5，优选为1:1.3；化合物B-1与4-二甲氨基吡啶的摩尔比为6.0-8.0:1，优选为7.3:1；化合物B-1与EDCI的摩尔比为1:0.8-1.5，优选为1:1.0；
6.根据权利要求3所述的硫代亚硝酸近红外生物发光探针的制备方法，其特征在
7.根据权利要求3所述的硫代亚硝酸近红外生物发光探针的制备方法，其特征在于，在步骤(6)中，化合物a与4-膦酰丁烯酸三乙酯的摩尔比为1.0-2.0:1，优选为1.6:1；化合物a与氢化钠的摩尔比为1.0-2.0:1，优选为1.3:1；在步骤(7)或步骤(9)中，所述碱性溶液为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或碳酸氢钠溶液；所述酸性溶液为盐酸溶液或硫酸溶液。
8.根据权利要求3所述的硫代亚硝酸近红外生物发光探针的制备方法，其特征在于，在步骤(8)中，化合物BF-2与S-三苯甲基-D-半胱氨酸甲酯的摩尔比为1:0.8-1.5，优选为1:1.1；化合物BF-2与EDCI的摩尔比为1:3.0-4.0，优选为1:3.4；化合物BF-2与4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:2.0-3.0，优选为1:2.6；化合物BF-2与三苯基氧膦的摩尔比为1:1.0-2.0，优选为1:1.5；化合物BF-2与三氟甲烷磺酸酐的摩尔比为1:0.5-1.0，优选为1:0.7。
9.根据权利要求3所述的硫代亚硝酸近红外生物发光探针的制备方法，其特征在于，在步骤(10)中，化合物BF-4与化合物B-5的摩尔比为1:1.5-2.5，优选为1:2.0；化合物BF-4与HBTU的摩尔比为1:0.8-1.5，优选为1:1.0；化合物BF-4与HOBt的摩尔比为1:0.8-1.5，优选为1:1.0；化合物BF-4与DIPEA的摩尔比为1:0.8-1.5，优选为1:1.0。
10.权利要求1所述的硫代亚硝酸近红外生物发光探针在检测硫代亚硝酸中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种硫代亚硝酸近红外生物发光探针，其生物发光探针的结构式如下所示：
2.一种权利要求1所述的硫代亚硝酸近红外生物发光探针的制备方法，其特征在于，其合成路线如下：
3.根据权利要求2所述的硫代亚硝酸近红外生物发光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的硫代亚硝酸近红外生物发光探针的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，对羟基苯甲醇和叔丁基二甲基氯硅烷的摩尔比为0.8-1.5:1，优选为1:1.0；对羟基苯甲醇和咪唑的摩尔比为0.8-1.5:1，优选为1.0:1；反应温度为20-40℃，优选为30℃。
5.根据权利要求3所述的硫代亚硝酸近红外生物发光探针的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，化合物b-1与2-氟-5-硝基苯甲酸的摩尔比为1:1.0-1.5，优选为1:1.3；化合物b-1与4-二甲氨基吡啶的摩尔比为6.0-8.0:1，优选为7.3:1；化合物b-1与edci的摩尔比为1:0.8-1.5，优选为1:1.0；
6.根据权利要求3所述的硫代亚硝酸近红外生物发光探针的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，化合物b-2和对甲苯磺酸的摩尔比为4.0-6.0:1，优选为5.2:1；在步骤(4)中，化合物b-3与k2co3的摩尔比为1:3.0-5.0，优选为1:3.8；化合物b-3与三光气的摩尔比为1:0.8-1.5，优选为1:1.0；化合物b-3与n-boc-1,2-亚苯基二胺的摩尔比为1.5-2.5:1，优选为2.3:1；化合物b-3与吡啶的摩尔比为1:3.5-4.5，...
【专利技术属性】
技术研发人员：张玲，严代玉，吕雳，薛运生，李佳怡，王佳乐，
申请(专利权)人：徐州医科大学，
类型：发明
国别省市：
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