【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开一般涉及通过改善从原位样本捕获mrna转录物的方法来产生空间转录组学mrna文库的方法，以及通过这些方法制备的mrna文库。
技术介绍
1、空间转录组学使得能够进行高分辨率原位基因表达谱分析，其中在复杂组织架构内捕获细胞关系。福尔马林固定的石蜡包埋的(ffpe)组织代表用于癌症研究的宝贵资源，因为它们是已知患者结果的最广泛可获得的材料(最近的估计表明全世界有>10亿个ffpe样本)。然而，已知福尔马林固定和随后的解交联在组织处理期间引起rna的降解和化学修饰，使得mrna的聚a捕获比在新鲜冷冻组织中更具挑战性。
技术实现思路
1、本公开提供了用于通过提高从组织样本捕获mrna转录物的效率从原位样本(例如新鲜冷冻或福尔马林固定的石蜡包埋的组织样本)产生mrna转录物文库的改善方法，从而产生更完整的转录组学文库。该方法可用于从患有疾病的患者中的样本(诸如肿瘤活检或其他组织)中分离基因组信息，并将遗传信息与患有疾病或处于患有疾病或发展疾病的风险相关联。
2、在一个方面，本公开提供了从组织样本制备mrna转录物表达文库的方法，该方法包括：a)将组织样本安装在包含多个捕获寡核苷酸的基底上，其中该捕获寡核苷酸包含第一聚类序列(例如，p7)、空间条形码序列(sbc)和第一通用衔接子序列(例如，rd2衔接子)；b)在使得一个或多个5'基因特异性探针和一个或多个3'基因特异性探针与组织样本中的一种或多种mrna转录物杂交的条件下，使该组织样本与以下物质接触：i)多个5'基因特
3、还考虑了确定组织样本中mrna转录物表达的方法，该方法包括a)将组织样本安装在包含多个捕获寡核苷酸的基底上，其中该捕获寡核苷酸包含第一聚类序列(例如，p7)、空间条形码序列(sbc)和第一通用衔接子序列(例如，rd2衔接子)；b)在使得一个或多个5'基因特异性探针和一个或多个3'基因特异性探针与组织样本中的一种或多种mrna转录物杂交的条件下，使该组织样本与以下物质接触：i)多个5'基因特异性探针，该多个5'基因特异性探针包含与该第一通用衔接子序列互补的序列以及5'基因特异性引物；和ii)多个3'基因特异性探针，该多个3'基因特异性探针包含3'基因特异性引物、独特分子索引和第二通用衔接子序列(例如，rd1衔接子)；c)将(b)中的组织样本与连接试剂接触，使得彼此邻近地与mrna转录物杂交的5'基因特异性探针和3'基因特异性探针连接在一起以形成一个或多个连接的基因特异性探针对；d)去除与连接的基因特异性探针对杂交的mrna转录物并留下连接的基因特异性探针对寡核苷酸序列；e)通过将与5'基因特异性探针中的第一通用衔接子序列互补的序列与捕获寡核苷酸的第一通用衔接子序列(例如，rd2衔接子)结合，将(d)的连接的基因特异性探针对寡核苷酸捕获在基底上。
4、在另一个方面，本公开提供了从组织样本制备mrna转录物表达文库的方法和/或从组织样本确定mrna转录物表达的方法，该方法包括：a)将组织样本安装在包含多个捕获寡核苷酸的基底上，其中该捕获寡核苷酸包含第一聚类序列(例如，p7)、空间条形码序列(sbc)和第一通用衔接子序列(例如，rd2衔接子)；b)在使得一个或多个5'基因特异性探针和一个或多个3'基因特异性探针与组织样本中的一种或多种mrna转录物杂交的条件下，使组织样本与以下物质接触：i)多个5'基因特异性探针，该5'基因特异性探针包含与第一通用衔接子序列互补的序列、独特分子索引和5'基因特异性引物；和ii)多个3'基因特异性探针，该多个3'基因特异性探针包含3'基因特异性引物和第二通用衔接子序列(例如，rd1衔接子)；c)将(b)中的组织样本与连接试剂接触，使得彼此邻近地与mrna转录物杂交的5'基因特异性探针和3'基因特异性探针连接在一起以形成一个或多个连接的基因特异性探针对；d)去除与连接的基因特异性探针对杂交的mrna转录物并留下连接的基因特异性探针对寡核苷酸序列；e)通过将与5'基因特异性探针中的第一通用衔接子序列互补的序列与捕获寡核苷酸的第一通用衔接子序列(例如，rd2衔接子)结合，将(d)的连接的基因特异性探针对寡核苷酸捕获在基底上。
5、在各种实施方案中，本公开提供了从组织样本制备mrna转录物表达文库的方法，该方法包括：a)将组织样本安装在包含多个捕获寡核苷酸的基底上，其中该捕获寡核苷酸包含第一聚类序列(例如，p7)、空间条形码序列(sbc)和第一通用衔接子序列(例如，rd2衔接子)；b)在使得一个或多个5'基因特异性探针和一个或多个3'基因特异性探针与组织样本中的一种或多种mrna转录物杂交的条件下，使该组织样本与以下物质接触：i)多个5'基因特异性探针，该多个5'基因特异性探针包含与该第一通用衔接子序列互补的序列以及5'基因特异性引物；和ii)多个3'基因特异性探针，该多个3'基因特异性探针包含3'基因特异性引物、独特分子索引和第二通用衔接子序列(例如，rd1衔接子)，其中5'基因特异性探针和3'基因特异性探针在mrna转录物上的杂交导致杂交分子之间的核苷酸缺口；c)使(b)中的组织样本与核苷酸碱基和连接试剂接触，使得与mrna转录物杂交的5'基因特异性探针和3'基因特异性探针之间的缺口被与mrna转录物互补的核苷酸碱基填充，并且5'基因特异性探针和3'基因特异性探针连接在一起以形成一个或多个连接的基因特异性探针对；d)去除与连接的基因特异性探针对杂交的mrna转录物并留下连接的基因特异性探针对寡核苷酸序列；以及e)通过将与5'基因特异性探针中的第一通用衔接子序列互补的序列与捕获寡核苷酸的第一通用衔接子序列(例如，rd2衔接子)结合，将(d)的连接的基因特异性探针对寡核苷酸序列捕获在基底上。
6、本公开还考虑了确定组织样本中mrna转录物表达的方法，该方法包括a)将组织样本安装在包含多个捕获寡核苷酸的基底上，其中该捕获寡核苷酸包含第一聚类序列(例如，p7)、空间条形码序列(sbc)和第一通用衔接子序列(例如，rd2衔接子)；b)在使得一个或多个5'基因特异性探针和一个或多个3'基因特异性探针与组织样本中的一种或多种mrna转录物杂交的条件下，使该组织样本与以下物质接触：i)多个5'基因特异性探针，该多个5'基因特本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种从组织样本制备mRNA转录物表达文库的方法，所述方法包括：
2.一种确定组织样本中mRNA转录物表达的方法，所述方法包括
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述3'基因特异性探针包含一个或多个核糖碱基。
4.一种从组织样本制备mRNA转录物表达文库的方法，所述方法包括：
5.一种分离组织样本中mRNA转录物表达的方法，所述方法包括
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述核苷酸缺口为1个至50个或更多个核苷酸。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，所述方法还包括对所述连接的基因特异性探针对进行索引和测序，包括：
8.根据权利要求7所述的方法，所述方法还包括对(h)的所述PCR产物进行测序，以及基于(a)的所述空间条形码确定所述mRNA转录物在所述组织中的位置。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述双链PCR产物包含在与所述第一链PCR产物互补的所述第二链上的第二聚类序列，并且任选地包含索引序列。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述第一聚类序列包含P7序列。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述第一通用衔接子序列包含GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:19)。0
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述第二通用衔接子序列包含AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTG(SEQ ID NO:20)。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述5'基因特异性探针和/或所述3'基因特异性探针具有约50℃至55℃的熔解温度(Tm)。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述捕获寡核苷酸具有约40℃至42℃的熔解温度(Tm)。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中步骤(b)在约50℃至55℃下进行。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中步骤(e)在约40℃至42℃下进行。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中使所述组织样本与所述基底的接触将所述基底上的捕获位点的位置与所述组织样本中的位置相关联，其中所述基底包括多个捕获位点，所述多个捕获位点包括固定在表面上的多个捕获探针，其中所述捕获探针包括空间地址区域。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述样本来自哺乳动物。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述样本来自人。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述组织样本是肿瘤活检。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述组织样本是福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织或新鲜冷冻(FF)组织。
23.一种鉴定患有疾病或处于患有疾病的风险中的受试者中的遗传变异的方法，所述方法包括：
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述疾病是遗传缺陷、癌症、自身免疫性疾病或代谢障碍。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述疾病是癌症。
26.一种用于从组织样本制备空间条形码化的RNA文库的方法，所述方法包括：
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述基底捕获探针还包含基底锚定部分。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述表面寡核苷酸还包含P7衔接子和用于读取所述空间条形码序列的RNA捕获探针引物。
29.一种用于从组织样本制备空间条形码化的RNA文库的方法，所述方法包括：
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述柄序列是PCR柄序列、分子标识符、UMI或它们的任何组合。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述柄序列是P5衔接子序列。
32.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中所述3'端寡核苷酸通过标签化添加。
33.根据权利要求29至32中任一项所述的方法，其中所述3'端寡核苷酸通过点击化学或oNTP指导的衔接化添加。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述3'OH通过用点击标记的核苷酸终止所述延伸反应来添加。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述点击标记的核苷酸是叠氮化物或炔标记的寡核苷酸。
<...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种从组织样本制备mrna转录物表达文库的方法，所述方法包括：
2.一种确定组织样本中mrna转录物表达的方法，所述方法包括
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述3'基因特异性探针包含一个或多个核糖碱基。
4.一种从组织样本制备mrna转录物表达文库的方法，所述方法包括：
5.一种分离组织样本中mrna转录物表达的方法，所述方法包括
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述核苷酸缺口为1个至50个或更多个核苷酸。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，所述方法还包括对所述连接的基因特异性探针对进行索引和测序，包括：
8.根据权利要求7所述的方法，所述方法还包括对(h)的所述pcr产物进行测序，以及基于(a)的所述空间条形码确定所述mrna转录物在所述组织中的位置。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述双链pcr产物包含在与所述第一链pcr产物互补的所述第二链上的第二聚类序列，并且任选地包含索引序列。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述5'基因特异性探针和/或所述3'基因特异性探针为10个至50个核苷酸。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述第一聚类序列包含p7序列。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述第一通用衔接子序列包含gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct(seq id no:19)。0
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述第二通用衔接子序列包含agatcggaagagcgtcgtgtagggaaagagtg(seq id no:20)。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述5'基因特异性探针和/或所述3'基因特异性探针具有约50℃至55℃的熔解温度(tm)。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述捕获寡核苷酸具有约40℃至42℃的熔解温度(tm)。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中步骤(b)在约50℃至55℃下进行。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中步骤(e)在约40℃至42℃下进行。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中使所述组织样本与所述基底的接触将所述基底上的捕获位点的位置与所述组织样本中的位置相关联，其中所述基底包括多个捕获位点，所述多个捕获位点包括固定在表面上的多个捕获探针，其中所述捕获探针包括空间地址区域。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述样本来自哺乳动物。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述样本来自人。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述组织样本是肿瘤活检。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述组织样本是福尔马林固定的石蜡包埋的(ffpe)组织或新鲜冷冻(ff)组织。
23.一种鉴定患有疾病或处于患有疾病的风险中的受试者中的遗传变异的方法，所述方法包括：
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述疾病是遗传缺陷、癌症、自身免疫性疾病或代谢障碍。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述疾病是癌症。
26.一种用于从组织样本制备空间条形码化的rna文库的方法，所述方法包括：
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述基底捕获探针还包含基底锚定部分。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述表面寡核苷酸还包含p7衔接子和用于读取所述空间条形码序列的rna捕获探针引物。
29.一种用于从组织样本制备空间条形码化的rna文库的方法，所述方法包括：
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述柄序列是pcr柄序列、分子标识符、umi或它们的任何组合。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述柄序列是p5衔接子序列。
32.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中所述3'端寡核苷酸通过标签化添加。
33.根据权利要求29至32中任一项所述的方法，其中所述3'端寡核苷酸通过点击化学或ontp指导的衔接化添加。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述3'oh通过用点击标记的核苷酸终止所述延伸反应来添加。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述点击标记的核苷酸是叠氮化物或炔标记的寡核苷酸。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述延伸反应将聚a序列添加到3'延伸的序列中。
37.根据权利要求29至36中任一项所述的方法，其中所述第一链cdna用所述表面捕获寡核苷酸上的聚t序列捕获。
38.一种用于从组织样本制备空间条形码化的rna文库的方法，所述方法包括：
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述第一结构域是聚t序列。
40.一种用于从组织样本制备空间条形码化的rna文库的方法，所述方法包括：
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述第一结构域是与所述tso上的所述聚c序列杂交的聚g序列。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述柄是p5序列，并且所述第二柄是p7序列。
43.一种用于从组织样本制备空间条形码化的rna文库的方法，所述方法包括：
44.根据权利要求43所述的方法，其中与所述样本中的rna互补的所述核苷酸序列是聚t寡核苷酸、随机寡核苷酸、半随机寡核苷酸或靶特异性序列。
45.根据权利要求43或44所述的方法，其中与所述样本中的rna互补的所述核苷酸序列是聚t寡核苷酸。
46.根据权利要求43所述的方法，其中从所述样本去除所述rna。
47.根据权利要求46所述的方法，其中在延伸形成第一链cdna后，从所述样本去除rna。
48.根据权利要求47所述的方法，其中通过酶促或热方法去除所述rna。
49.一种用于从组织样本制备空间条形码化的rna文库的方法，所述方法包括：
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述接头是不能被聚合酶通读的接头。
51.一种用于从组织样本制备空间条形码化的rna文库的方法，所述方法包括：
52.一种用于从组织样本制备空间条形码化的rna文库的方法，所述方法包括：
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述多聚腺苷酸化使用聚a聚合酶进行。
54.一种用于从组织样本制备空间条形码化的rna文库的方法，所述方法包括：
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述连接用t4连接酶进行。
56.根据权利要求54所述的方法，其中所捕获的rna-rn...
【专利技术属性】
技术研发人员：A·奥斯特罗，S·克拉蒙斯，J·胡，M·埃卡斯特兰德，J·曼斯，C·爱普瑞，A·曼佐，J·费希尔，B·马泽，G·卡珀，A·怀特，
申请(专利权)人：伊鲁米那股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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