【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于干细胞，具体涉及包含间充质干细胞的产品、制备方法、质量控制方法以及在消化系统疾病中的防治应用。
技术介绍
1、脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。脐带间充质干细胞的分泌物在疾病治疗中扮演着重要角色。这些分泌物包括多种生长因子、细胞因子、趋化因子和免疫调节分子等，它们通过不同的机制对疾病产生治疗作用。
2、培养方法对脐带间充质干细胞的影响是显著的，不同的培养方法会直接影响脐带间充质干细胞的生长速度和增殖能力。例如，原代培养方法中的组织贴壁法和酶消化法(如胰酶、胶原酶消化法)在细胞分离和培养效率上存在差异。有研究表明，组织贴壁法培养脐带间充质干细胞的成功率较高，且细胞在培养过程中能够较好地保持其基本性质)。此外，培养基的配方、培养条件(如温度、co浓度、湿度)以及培养器的选择也会对细胞的生长情况产生影响。
3、就培养基的配方而言，碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)和表皮生长因子(egf)可促进干细胞生长、增殖和并维持干细胞干性，而基质细胞衍生因子-1α(sdf-1α)具有促进干细胞归巢、趋化和增殖的作用，在间充质干细胞分离培养早期使用可加快干细胞从脐带等组织中分离获取的速度并有利于保持干细胞活性；谷胱甘肽和α酮戊二酸可为干细胞生长提供能量、降低氧自由基损伤并参与干细胞分化调控；而维生素c和e则可调节干细胞功能、维持细胞膜完整并延缓细胞衰老。最近的研究结果显示氢气氢
4、不同的培养方法对还会对脐带间充质干细胞分泌胰岛素样生长因子-1(igf-1)和角质细胞生长因子(kgf)等生物活性分子具有显著影响。有研究表明，通过基因转染技术将igf-1基因导入脐带间充质干细胞中，可以显著提高细胞分泌igf-1的能力。此外，优化培养条件(如调整培养基中营养成分的比例、添加生长因子等)也可能对igf-1的分泌产生积极影响。不同培养方法对脐带间充质干细胞分泌kgf的影响同样重要。一方面，适宜的培养条件能够保持细胞的活性和稳定性，从而有利于kgf的分泌。另一方面，通过构建表达kgf的重组质粒并转化至脐带间充质干细胞中，可以实现kgf的高效表达。这种方法不仅可以提高kgf的产量，还可以进一步研究kgf对细胞增殖、分化等生物学过程的影响。lif是一种多功能细胞因子，具有促进细胞生长、抑制细胞凋亡等多种生物学活性。然而，关于不同培养方法对脐带间充质干细胞分泌lif的具体影响，目前的研究相对较少，且可能因实验条件、细胞来源等因素而有所不同。
5、基因转染技术以及重组质粒在生物医学研究和治疗中具有重要作用，但确实也存在一定的危害。基因转染技术会存在细胞损伤、基因整合问题(外源基因在导入细胞后，可能会随机整合到宿主细胞的基因组中，导致基因组的稳定性和遗传特性的改变)、免疫反应以及伦理问题。而重组质粒也会存在毒性问题、遗传稳定性问题以及水平基因转移等。
6、因此，亟需开发一种安全有效的培养方法，用以获得高质量的脐带间充质干细胞分泌物并提高治疗效果。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术提供了一种间充质干细胞的制备方法，可有效提高细胞质量，并对消化系统及疾病具有显著的疗效。
2、一方面，本专利技术提供了一种间充质干细胞的制备方法，所述制备方法的步骤如下：
3、(1)将组织处理后进行孵育，加入完全培养液1中进行培养；培养至细胞融合度为70-90％时，使用消化液消化，得p0代间充质干细胞；
4、(2)将p0代间充质干细胞离心，弃上清，加入完全培养液2进行第一次传代培养，得p1代间充质干细胞；
5、(3)将p1代间充质干细胞离心，弃上清，加入完全培养液3进行第二次传代培养，得p2代间充质干细胞；
6、(4)将p2代间充质干细胞离心，弃上清，收获间充质干细胞，得到种子库细胞。
7、(5)将种子库细胞加入完全培养液3培养至p5代，获得间充质干细胞。
8、所述的完全培养液1由fbs、bfgf、egf、sdf-1α和基础培养基组成；
9、所述的完全培养液2由fbs、bfgf、egf、、sdf-1α谷胱甘肽、氢气和基础培养基组成；
10、所述的完全培养液3由fbs、bfgf、egf、、sdf-1α维生素c、谷胱甘肽和基础培养基组成。
11、具体地，步骤(1)所述培养的条件包括5％co2，1％-2％o2；
12、步骤(2)所述第一次传代培养的条件包括5％co2，5％-10％o2；
13、步骤(3)所述第二次传代培养的条件包括5％co2，18％-20％o2；
14、步骤(5)所述培养的条件包括5％ co2。
15、进一步具体地，一些实施例中，步骤(1)所述培养的条件包括5％co2，1％o2；
16、步骤(2)所述第一次传代培养的条件包括5％co2，5％o2；
17、步骤(3)所述第二次传代培养的条件包括5％co2，20％o2；
18、步骤(5)所述培养的条件包括5％ co2。
19、在另一些实施例中，步骤(1)所述培养的条件包括5％co2，2％o2；
20、步骤(2)所述第一次传代培养的条件包括5％co2，10％o2；
21、步骤(3)所述第二次传代培养的条件包括5％co2，18％％o2；
22、步骤(5)所述培养的条件包括5％ co2。
23、具体地，所述基础培养基包括mesencult-xf medium、essential 8medium、stempro hesc sfm、cts essential 6medium、dmem/f12或dmem中的一种或多种。
24、优选地，所述基础培养基为dmem/f12。
25、具体地，所述完全培养液1由10-15％v/v fbs、5-10μg/l bfgf、5-10μg/legf、100-200μg/l sdf-1α和dmem/f12培养基组成；
26、所述完全培养液2由10-15％v/v fbs、5-10μg/l bfgf、5-10μg/l egf、100-200μg/l sdf-1α、1-25μg/l谷胱甘肽、0.5-1.5mg/l氢气和dmem/f12培养基组成；
27、所述完全培养液3由10-15％v/v fbs、5-10μg/l bfgf、5-10μg/l egf、100-200μg/l sdf-1α、5-10mg/l维生素c、1-25μg/l谷胱甘肽和dmem/f12培养基组成。
28、进一步具体地，所述完全培养液1由10％v/v fbs、5-10μg/l bfgf、5-10μg/本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤如下：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述培养的条件包括5％CO2，1％-2％O2；
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述基础培养基包括MesenCult-XFMedium、Essential 8Medium、StemPro hESC SFM、CTS Essential 6Medium、DMEM/F12或DMEM中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述完全培养液1由10-15％v/v FBS、5-10μg/L bFGF、5-10μg/L EGF、100-200μg/L SDF-1α和DMEM/F12培养基组成；
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞来源于骨髓、脂肪组织、脐带、脐带血或胎盘组织。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞来源于脐带
8.权利要求1-6任一项所述的制备方法获得的间充质干细胞。
9.根据权利要求8所述的间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞的浓度为1×106-1×108cells/mL。
10.一种培养物，其特征在于，所述培养物包括权利要求8或9所述的间充质干细胞，其生物学效力检测指标包括间充质干细胞分泌的HGF、IGF-1和KGF水平。
11.权利要求8或9所述的间充质干细胞或权利要求10所述的培养物在制备治疗消化系统疾病的药物中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述消化系统疾病包括炎症性肠病、慢性肝纤维化和急性肝衰竭。
13.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂、凝胶剂、细胞膜片、贴片、微球、微粒或复合材料。
14.权利要求8或9所述的间充质干细胞的质量控制方法，其特征在于，包括对间充质干细胞进行细胞形态、细胞流式表型、细胞增殖、成骨成脂分化能力或生物学效力检测中的一种或多种。
15.根据权利要求14所述的质量控制方法，其特征在于，所述细胞流式表型包括CD73、CD90、CD105、CD19、CD34、CD45、CD11b或HLA-DR中的一种或多种。
16.根据权利要求14所述的质量控制方法，其特征在于，所述生物学效力检测包括HGF、KGF或IGF-1中的一种或多种。
...【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤如下：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述培养的条件包括5％co2，1％-2％o2；
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述基础培养基包括mesencult-xfmedium、essential 8medium、stempro hesc sfm、cts essential 6medium、dmem/f12或dmem中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述基础培养基为dmem/f12。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述完全培养液1由10-15％v/v fbs、5-10μg/l bfgf、5-10μg/l egf、100-200μg/l sdf-1α和dmem/f12培养基组成；
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞来源于骨髓、脂肪组织、脐带、脐带血或胎盘组织。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞来源于脐带。
8.权利要求1-6任一项所述的制备方法获得的间充质干细胞。
9.根据权利要求8所述的间充质干细...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘广洋，刘拥军，李欣，陈瑶瑶，张晨亮，米一，徐利强，
申请(专利权)人：北京贝来药业有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。