【技术实现步骤摘要】
本申请涉及生物医药，尤其涉及一种hib荚膜多糖的制备方法。
技术介绍
1、流感嗜血杆菌(haemop hilus inf luenz ae hi)是引起婴幼儿呼吸系统原发性感染和病毒性感染后引起继发性感染的重要病原体。根据荚膜多糖的组成成分和抗原性，又可分成a,b,c,de,f六个血清型，而b型流感嗜血杆菌(haemop hilus inf luenz ae typeb hib)是对人类危害最大的一型。hib是一类革兰氏阴性小杆菌，是一种可以引起婴幼儿化脓性脑膜炎、肺炎、会厌炎、化脓性关节炎等局部和侵染性感染的病原体，在5岁以下的婴幼儿中较为常见。在引起小儿化脓性脑膜炎的病例中，死亡率可达3％～5％，存活者中有15％～30％的病例有不同程度的神经系统后遗症。
2、hib危害较大，且治疗相对复杂，因而接种疫苗是预防绝大多数hib病例的最佳方式。hib疫苗，是由纯化的hib荚膜多糖与结合蛋白共价结合生产的，而hib荚膜多糖的制备是其中的关键。
3、现有的hib荚膜多糖的制备工艺，主要采用发酵培养hib细菌，灭菌后经过一系列纯化步骤制得hib荚膜多糖。目前，现有技术中对于hib荚膜多糖的纯化主要有两种方式。第一种是灭菌后去除菌体，而后用乙醇沉淀法去除核酸，用冷酚法去除蛋白，最后采用乙醇沉淀法精制，得到纯化的hib荚膜多糖。第二种是灭菌后去除菌体，而后经一系列过滤、超滤，得到上清液，最后用高浓度乙醇提取制得粗糖，最后经精制处理，得到纯化的hib荚膜多糖。然而，现有技术中，无论采用何种工艺，均存在产率较低，制得的h
技术实现思路
1、为了解决上述至少一种技术问题，开发一种产率相对较高，制得的hib荚膜多糖杂质含量较低，且成本相对低廉的制备方法，本申请提供一种hib荚膜多糖的制备方法。
2、本申请提供了一种hib荚膜多糖的制备方法，包括以下步骤：
3、s1、将hib菌株接种至添加有发酵培养液的发酵罐中，接种率为6.5～8.5％，调节ph至7.4～7.6，在35～37℃温度下，搅拌培养10～12h，得到发酵液；
4、s2、向步骤s1得到的发酵液中添加双氧水搅拌灭菌30min以上，将灭菌后的发酵液在7500～7800xg下离心除菌，得到除菌发酵液；
5、s3、向步骤s2得到的除菌发酵液中添加ctab沉淀荚膜多糖，收集沉淀，得到粗糖；
6、s4、将步骤s3得到的粗糖用乙酸钠溶液溶解，而后向溶解液中添加核糖核酸酶a和脱氧核糖核酸酶i分解核酸，而后添加蛋白酶k分解蛋白，得到粗糖液；
7、s5、将步骤s4得到的粗糖液，维持56～60℃温度，添加苯酚萃取蛋白杂质，收集上清液，得到荚膜多糖混合液；
8、s6、向步骤s5得到的荚膜多糖混合液中添加无水乙醇，维持混合液中乙醇终浓度在70～75％，沉淀荚膜多糖，得到荚膜多糖沉淀；
9、s7、将步骤s6得到的荚膜多糖沉淀用氯化钠溶液解离，而后用氯化钠溶液和注射用水超滤，将超滤液冻干处理，制得hib荚膜多糖。
10、通过采用上述技术方案，本申请采用发酵hib菌株，而后灭菌除菌，再经纯化处理的方式制备hib荚膜多糖，并采用双氧水灭菌，避免使用甲醛，更为环保且无需后续除醛处理；本申请的纯化过程采用先沉淀粗糖，而后用核酸酶和蛋白酶分解核酸和蛋白杂质，最后用苯酚萃取去除剩余蛋白杂质的工艺步骤，避免了乙醇沉淀法和超滤法除核酸导致的hib荚膜多糖损失，不但能提高hib荚膜多糖的产率，而且能有效降低hib荚膜多糖中杂质的含量；本申请采用乙醇沉淀法对荚膜多糖混合液沉淀制糖，而后用超滤的方式除酚，对经除核酸和蛋白的荚膜多糖混合液精制处理，在保证产率的前提下，能够进一步降低hib荚膜多糖中杂质的含量，大幅提高了hib荚膜多糖的品质。
11、可选的，所述步骤s1中，发酵培养液的各组分浓度配比包括：牛酪蛋白胨20～25g/l、肉蛋白胨15～20g/l、葡萄糖60～80g/l、磷酸氢二钾6～8g/l、氯化钠3～5g/l、血色素100～120mg/l、琼脂800～1000mg/l、复合维生素400～500mg/l，以及抗生素25～50mg/l。
12、可选的，所述步骤s1中，搅拌培养包括以下步骤：先搅拌培养4h，补充300～350g/l葡萄糖后继续搅拌培养3h，再次补充150～200g/l葡萄糖后继续搅拌培养至培养结束。
13、通过采用上述技术方案，本申请采用特定的发酵培养液和培养步骤后，能够大幅提高最终发酵液中hib菌的含量，进一步有效提高hib荚膜多糖的产率。
14、可选的，所述步骤s2中，添加双氧水至终浓度4～6％，搅拌灭菌30min以上。
15、可选的，所述步骤s3中，添加ctab至终浓度0.1％。
16、可选的，所述步骤s4中，溶解采用3.8～4％的乙酸钠溶液，溶解液中粗糖浓度控制在40～50g/l；添加核糖核酸酶a至终浓度0.1～0.15g/l，添加脱氧核糖核酸酶i至终浓度0.1～0.15g/l，添加蛋白酶k至终浓度0.1～0.15g/l。
17、可选的，所述步骤s4中，分解核酸的具体步骤为36～38℃温度下孵育10～12h，分解蛋白的具体步骤为56～60℃温度下孵育4～6h。
18、通过采用上述技术方案，本申请采用特定的配液比添加核酸酶和蛋白酶，在确保hib荚膜多糖产率，能够进一步有效去除核酸和蛋白杂质的同时，还能有效控制成本。
19、可选的，所述步骤s5中，添加苯酚萃取蛋白杂质，按照粗糖液与苯酚的体积比为1:1～1.1配液，萃取2次。
20、可选的，所述步骤s6中，沉淀荚膜多糖在4℃水浴下进行。
21、可选的，所述步骤s7中，冻干处理采用真空冷冻干燥72h以上的方式进行。
22、综上所述，本专利技术包括以下至少一种有益技术效果：
23、1.本申请采用发酵hib菌株，而后灭菌除菌，再经纯化处理的方式制备hib荚膜多糖，并采用双氧水灭菌，避免使用甲醛，更为环保且无需后续除醛处理。
24、2.本申请的纯化过程采用先沉淀粗糖，而后用核酸酶和蛋白酶分解核酸和蛋白杂质，最后用苯酚萃取去除剩余蛋白杂质的工艺步骤，避免了乙醇沉淀法和超滤法除核酸导致的hib荚膜多糖损失，不但能提高hib荚膜多糖的产率，而且能有效降低hib荚膜多糖中杂质的含量。
25、3.本申请采用乙醇沉淀法对荚膜多糖混合液沉淀制糖，而后用超滤的方式除酚，对经除核酸和蛋白的荚膜多糖混合液精制处理，在保证产率的前提下，能够进一步降低hib荚膜多糖中杂质的含量，大幅提高了hib荚膜多糖的品质。
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1.一种Hib荚膜多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的Hib荚膜多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，发酵培养液的各组分浓度配比包括：牛酪蛋白胨20～25g/L、肉蛋白胨15～20g/L、葡萄糖60～80g/L、磷酸氢二钾6～8g/L、氯化钠3～5g/L、血色素100～120mg/L、琼脂800～1000mg/L、复合维生素400～500mg/L，以及抗生素25～50mg/L。
3.根据权利要求1所述的Hib荚膜多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，搅拌培养包括以下步骤：先搅拌培养4h，补充300～350g/L葡萄糖后继续搅拌培养3h，再次补充150～200g/L葡萄糖后继续搅拌培养至培养结束。
4.根据权利要求1所述的Hib荚膜多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，添加双氧水至终浓度4～6％，搅拌灭菌30min以上。
5.根据权利要求1所述的Hib荚膜多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，添加CTAB至终浓度0.1％。
6.根据权利要求1所述的Hib荚膜多糖的制备
7.根据权利要求1所述的Hib荚膜多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，分解核酸的具体步骤为36～38℃温度下孵育10～12h，分解蛋白的具体步骤为56～60℃温度下孵育4～6h。
8.根据权利要求1所述的Hib荚膜多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中，添加苯酚萃取蛋白杂质，按照粗糖液与苯酚的体积比为1:1～1.1配液，萃取2次。
9.根据权利要求1所述的Hib荚膜多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤S6中，沉淀荚膜多糖在4℃水浴下进行。
10.根据权利要求1所述的Hib荚膜多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤S7中，冻干处理采用真空冷冻干燥72h以上的方式进行。
...【技术特征摘要】
1.一种hib荚膜多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的hib荚膜多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中，发酵培养液的各组分浓度配比包括：牛酪蛋白胨20～25g/l、肉蛋白胨15～20g/l、葡萄糖60～80g/l、磷酸氢二钾6～8g/l、氯化钠3～5g/l、血色素100～120mg/l、琼脂800～1000mg/l、复合维生素400～500mg/l，以及抗生素25～50mg/l。
3.根据权利要求1所述的hib荚膜多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中，搅拌培养包括以下步骤：先搅拌培养4h，补充300～350g/l葡萄糖后继续搅拌培养3h，再次补充150～200g/l葡萄糖后继续搅拌培养至培养结束。
4.根据权利要求1所述的hib荚膜多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤s2中，添加双氧水至终浓度4～6％，搅拌灭菌30min以上。
5.根据权利要求1所述的hib荚膜多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤s3中，添加ctab至终浓度0.1％。
【专利技术属性】
技术研发人员：夏旭捷，蔡轲，马伟，
申请(专利权)人：艾美坚持生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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