【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及由各种种类的细胞制作细胞片的方法。特别是涉及细胞片的制作方法，该细胞片是由包含视网膜色素上皮细胞、间充质干细胞、成纤维细胞、ips细胞诱导多能干细胞及ips来源分化细胞、es细胞及es细胞来源最终细胞的各式各样的细胞制作的。
技术介绍
1、为了治疗各式各样的疾病，已报道有细胞培养片的移植疗法。所谓细胞培养片的移植疗法是如下技术：将由人体采集或人工制作的干细胞在孔板(培养皿)中培养，将所获得的片状的培养细胞配置于由外伤或疾病等所造成的组织的缺损部，将缺损部修复。
2、已尝试有如下方法：以接近在生物体内的形态的细胞片的状态，将视网膜色素上皮细胞移植来治疗视网膜变性疾病。例如，老年黄斑变性的治疗，将视网膜色素上皮细胞或视网膜色素上皮移植到视网膜下的缺损部位的方法是有效的治疗方法(专利文献1：日本特表平9-501303号公报，专利文献2：日本特开2008-173333号公报)。虽然已实行了将由老年黄斑变性患者的视网膜组织切出的视网膜色素上皮细胞(制成伴随脉络膜的层)而成的细胞片，移植至受到损伤的黄斑部分这样的自体组织移植，但是该源自患者组织的细胞片仍有下述问题：除了移植手术之外还增加了患者视网膜的切除手术所造成的侵入性风险，并发症的发病率高，并且移植后确认黄斑功能的改善、稳定维持的效果的比例低。
3、作为不依赖患者视网膜的采集而利用在生物体外培养的视网膜色素上皮细胞和虹膜色素上皮细胞等色素上皮细胞的方法，已知有将在人工膜或羊膜上培养色素上皮细胞而制成的细胞片用于移植的方法。但是，人工膜的组成、性质、
4、然而，期望一种更简便且效率良好的细胞片的制作方法。此外，所制成的细胞片要自培养皿剥离而用于移植，但是剥离后的细胞片会自支撑体(平面基材)分离，因此会有在医疗现场实行移植之前形状容易变化而处理不易这样的问题。
5、此外，以对移植后的色素上皮供给营养和氧气为目的，已报道有一种细胞片的制造方法，该细胞片包含色素上皮细胞层及血管生成细胞层(专利文献4：wo2014/030749)。
6、间充质干细胞(msc：mesenchymal stem cell)是具有多分化能力及自我复制能力的干细胞，具有分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞这样的源自中胚层的细胞的能力，除此之外，还被报道有也能分化为源自外胚层的神经细胞、神经胶质细胞、源自内胚层的肝细胞的能力。msc已知还具有归巢效应、旁分泌效应及细胞粘附相互作用。认为msc基于这些作用，发挥目标组织、细胞的修复/再生能力以及抗炎症等免疫控制能力，其结果显示了对各式各样疾病的治疗效果。
7、已报道有使用msc的细胞移植疗法，例如已报道有一种治疗肾脏疾病的尝试，其通过将包含msc的细胞片组合物应用于肾脏(专利文献5：日本特开2017-132744)。
8、虽然已报道有使用了各式各样的细胞的细胞片的制作方法，但是尚未出现能够应用于包含msc或皮肤组织的细胞即成纤维细胞的各种种类的细胞的细胞片的制作方法，期望确立一种能够应用于范围广泛的细胞种类的细胞片的制作方法。
9、现有技术文献
10、专利文献
11、专利文献1：日本特表平9-501303号公报
12、专利文献2：日本特开2008-173333号公报
13、专利文献3：wo2011/142364
14、专利文献4：wo2014/030749
15、专利文献5：日本特开2017-132744号公报
技术实现思路
1、专利技术要解决的问题
2、本专利技术的目的在于提供一种细胞片的制作方法，其为简便的细胞片的制作方法，并且通过该方法所制成的细胞片容易处理。本专利技术的目的还在于提供一种简便的细胞片的制作方法，其能够应用于各式各样的细胞。
3、用于解决问题的方案
4、专利技术人致力于研究一种细胞片的制作方法，其为简便的细胞片的制作方法，并且通过该方法所制成的细胞片容易处理，结果发现可利用底面具有多孔性膜的细胞培养容器来培养细胞，进而完成本专利技术。
5、本专利技术包括以下方案。
6、[1]一种细胞片的制作方法，其包括以下工序：
7、工序(1)，制备一种或多种的源自哺乳动物的细胞；
8、工序(2)，将制备的细胞播种于底面具有多孔性膜的第一细胞培养容器的前述多孔性膜上；及
9、工序(3)，将前述第一细胞培养容器放入第二细胞培养容器中，培养细胞，在前述多孔性膜上制作细胞片。
10、[2]如上述[1]所述的方法，其中，前述第一细胞培养容器中的培养液或前述第二细胞培养容器中的培养液中的至少一者为包含血清和/或rho激酶(rock)抑制剂的培养液。
11、[3]如上述[1]或[2]所述的方法，其中，在工序(1)中，源自哺乳动物的细胞为上皮细胞、内皮细胞、实质细胞或干细胞。
12、[4]如上述[3]所述的方法，其中，在工序(1)中，源自哺乳动物的细胞是选自由色素上皮细胞(例如虹膜色素上皮细胞、视网膜色素上皮细胞)、成纤维细胞及间充质干细胞所组成的组中的细胞。
13、[5]如上述[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，在工序(2)中，以5000细胞数/mm2(优选为10000细胞数/mm2)以上将细胞播种于底面上。
14、[6]如上述[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，在进行培养所获得的细胞片中，在细胞的与前述多孔性膜接触一侧的相反侧形成有包含细胞外基质的膜。
15、[7]如上述[6]所述的方法，其中，进行培养所获得的细胞片进一步在细胞之间形成有紧密连接(tight junction)。
16、[8]如上述[6]或[7]所述的方法，其进一步包括以下的工序(4)：
17、工序(4)，确认在细胞的与前述多孔性膜接触一侧的相反侧形成有包含细胞外基质的膜。
18、[9]如上述[1]～[8]中任一项所述的方法，其进一步包括以下的工序(5)：
19、工序(5)，确认由工序(3)所获得的培养细胞中有无分化标记物的表达。
20、前述分子标记物如下：当前述源自哺乳动物的细胞是视网膜色素上皮细胞等或虹膜本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种细胞片的制作方法，其包括以下工序：
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一细胞培养容器中的培养液或所述第二细胞培养容器中的培养液中的至少一者为包含血清和/或Rho激酶(ROCK)抑制剂的培养液。
3.如权利要求1所述的方法，其中，在工序(1)中，源自哺乳动物的细胞为上皮细胞、内皮细胞、实质细胞或干细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述源自哺乳动物的细胞是选自由色素上皮细胞、成纤维细胞及间充质干细胞所组成的组中的细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其中，在工序(2)中，以5000细胞数/mm2以上将细胞播种于底面上。
6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，在进行培养所获得的细胞片中，在细胞的与所述多孔性膜接触一侧的相反侧形成有包含细胞外基质的膜。
7.如权利要求6所述的方法，其中，进行培养所获得的细胞片进一步在细胞之间形成有紧密连接。
8.如权利要求6所述的方法，其进一步包括以下的工序(4)：
9.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其进一步包括以下的工序(5
10.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其进一步包括以下的工序(5’)：
11.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，在工序(1)中，源自哺乳动物的细胞是视网膜色素上皮细胞、虹膜色素上皮细胞、间充质干细胞或成纤维细胞，并且，在工序(2)中，以5000细胞数/mm2～40000细胞数/mm2将细胞播种于底面上。
12.一种细胞片，其是由权利要求1～5中任一项所述的方法所制成的。
13.一种疾病治疗用移植材料，其包含由权利要求1～5中任一项所述的方法所制成的细胞片。
14.一种包含细胞外基质的膜的制作方法，其包括如下工序：将形成于细胞片的包含细胞外基质的膜进行分离，该细胞片是由权利要求1～5中任一项所述的方法所制成的。
15.一种细胞片，其是配置于多孔性膜上的源自哺乳动物的细胞的细胞片，在该细胞片中，在细胞之间存在有细胞外基质，且在与所述多孔性膜接触一侧的相反侧形成有包含细胞外基质的膜。
16.如权利要求15所述的细胞片，其中，所述细胞片进一步在细胞之间形成有紧密连接。
17.如权利要求15所述的细胞片，其中，所述细胞片通过如下方式获得：将1种或多种的源自哺乳动物的细胞播种于第一细胞培养容器的底面的多孔性膜上，将该第一细胞培养容器放入第二细胞培养容器中进行培养。
18.如权利要求17所述的细胞片，其中，所述第一细胞培养容器中的培养液或所述第二细胞培养容器中的培养液中的至少一者为包含血清和/或Rho激酶(ROCK)抑制剂的培养液。
19.如权利要求17或18所述的细胞片，其中，所述源自哺乳动物的细胞为上皮细胞、内皮细胞、实质细胞或干细胞。
20.如权利要求19所述的细胞片，其中，所述源自哺乳动物的细胞是选自由色素上皮细胞、成纤维细胞及间充质干细胞所组成的组中的细胞。
21.如权利要求19所述的细胞片，其中，所述源自哺乳动物的细胞是视网膜色素上皮细胞或虹膜色素上皮细胞。
22.如权利要求19所述的细胞片，其中，所述细胞片中所包含的细胞表达选自由下述物质组成的组中的至少一种分子标记物：卵黄状黄斑病蛋白-1、RPE-65、广谱细胞角蛋白及细胞角蛋白中的任一种亚型、闭合蛋白、ZO-1、弹性蛋白、肌动蛋白、1型胶原蛋白、2型胶原蛋白及4型胶原蛋白。
23.如权利要求19所述的细胞片，其中，所述细胞片中所包含的细胞分泌有可溶性Flt-1(VEGF受体1)和/或TIMP-3。
24.一种多层化细胞片的制造方法，其包括下述工序(1)～(4)：
25.一种多层细胞片，其由权利要求24所述的方法制造而成。
26.一种多层细胞片，其配置于多孔性膜上，在多层细胞片所包含的各细胞片中，在细胞之间存在有细胞外基质，且在与所述多孔性膜接触一侧的相反侧形成有包含细胞外基质的膜。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种细胞片的制作方法，其包括以下工序：
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一细胞培养容器中的培养液或所述第二细胞培养容器中的培养液中的至少一者为包含血清和/或rho激酶(rock)抑制剂的培养液。
3.如权利要求1所述的方法，其中，在工序(1)中，源自哺乳动物的细胞为上皮细胞、内皮细胞、实质细胞或干细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述源自哺乳动物的细胞是选自由色素上皮细胞、成纤维细胞及间充质干细胞所组成的组中的细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其中，在工序(2)中，以5000细胞数/mm2以上将细胞播种于底面上。
6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，在进行培养所获得的细胞片中，在细胞的与所述多孔性膜接触一侧的相反侧形成有包含细胞外基质的膜。
7.如权利要求6所述的方法，其中，进行培养所获得的细胞片进一步在细胞之间形成有紧密连接。
8.如权利要求6所述的方法，其进一步包括以下的工序(4)：
9.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其进一步包括以下的工序(5)：
10.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其进一步包括以下的工序(5’)：
11.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，在工序(1)中，源自哺乳动物的细胞是视网膜色素上皮细胞、虹膜色素上皮细胞、间充质干细胞或成纤维细胞，并且，在工序(2)中，以5000细胞数/mm2～40000细胞数/mm2将细胞播种于底面上。
12.一种细胞片，其是由权利要求1～5中任一项所述的方法所制成的。
13.一种疾病治疗用移植材料，其包含由权利要求1～5中任一项所述的方法所制成的细胞片。
14.一种包含细胞外基质的膜的制作方法，其包括如下工序：将形成于细胞片的包含细胞外基质的膜进行分离，该细胞片是由权利要求1～5中任一项所述的方法所制成的。
15.一种细胞片，其是配置于多孔性膜上的源自...
【专利技术属性】
技术研发人员：草野仁，宫内英征，酒井秀人，柳川聪秀，冈崎道贵子，田面喜之，
申请(专利权)人：生物制药株式会社，
类型：发明
国别省市：
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