【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物，尤其是一种干酪乳杆菌iob-p9抗幽门螺杆菌活性物质分离的制备和分离纯化方法和应用。
技术介绍
1、幽门螺旋杆菌是一种生长于胃粘膜层的革兰氏阴性细菌，是慢性胃炎、消化性溃疡的主要致病因素，也是胃癌的主要诱发因子。幽门螺旋杆菌感染与胃炎、胃和十二指肠溃疡等胃并发症的发生有关。致癌性感染导致的胃癌中，幽门螺杆菌相关胃癌所占比例最大。也有研究表明，77％以上的新发胃癌病例和89％以上的新发非心源性胃癌病例与幽门螺杆菌感染有关，可见，幽门螺旋杆菌引起的消化系统疾病已经成为全球重大公共卫生问题。
2、在过去的二十年中，根除幽门螺杆菌的推荐治疗是标准的三联疗法，这些疗法的根除率超过90％，加上安全性，在临床医生中获得了很高的接受度。但由于幽门螺杆菌对抗生素耐药率增加，三联疗法的疗效已降至70％以下，不再是幽门螺杆菌的最佳治疗方法。一些研究开始将与抗生素相关的益生菌作为一种治疗方法。益生菌被定义为“活的有益微生物”，当给予足够的量时，能给宿主健康带来益处。它们可以通过分泌抗菌代谢产物来减少幽门螺杆菌的定植，调节宿主免疫反应，减少炎性因子的表达从而缓解幽门螺杆菌感染所致的胃部炎症。
3、目前，对于该疾病的治疗仍然缺乏有效的药物，筛选具有抑制幽门螺旋杆菌的候选化合物，对于开发治疗胃炎等胃肠道疾病药物具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种干酪乳杆菌iob-p9抗幽门螺杆菌活性物质分离的制备和分离纯化方法和应
2、本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
3、一种干酪乳杆菌iob-p9在制备治疗幽门螺旋杆菌药物中的应用，所述干酪乳杆菌iob-p9于2021年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，其保藏编号为cgmcc no.24195。
4、一种干酪乳杆菌iob-p9在制备抑制和杀灭幽门螺旋杆菌药物中的应用，所述干酪乳杆菌iob-p9于2021年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，其保藏编号为cgmcc no.24195。
5、一种干酪乳杆菌iob-p9抗幽门螺杆菌活性物质分离的制备和分离纯化方法，包括如下步骤：
6、(1)干酪乳杆菌iob-p9的培养和活性成份的制备；
7、(2)活性成份的大孔吸附层析法分离；
8、(3)活性成份的阴离子交换法分离；
9、(4)活性成份的凝胶过滤层析分离；
10、(5)活性成份的活性验证，得到干酪乳杆菌iob-p9活性成份；
11、所述干酪乳杆菌iob-p9于2021年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，其保藏编号为cgmcc no.24195。
12、进一步地，步骤(1)包括：菌种活化和发酵培养，种子的最佳种龄为20-24h，接种量为1％，发酵时间为48h；其中，种子培养基为脱脂豆粉40g/l，葡萄糖10g/l，溶剂为水；发酵培养基为高温豆粕90g/l，葡萄糖5g/l，麸皮粉1g/l，溶剂为水。
13、步骤(2)中，大孔吸附层析法分离活性物质的操作步骤为：
14、a.xad-16n大孔吸附树脂在无水乙醇中浸泡24小时，以使树脂充分膨胀，然后用超纯水冲洗干净，并依次在质量浓度4％hcl和质量浓度4％naoh溶液中浸泡5小时；随后，用超纯水洗涤树脂，直至达到中性状态；
15、b.柱子用超纯水冲洗干净；
16、c.将发酵液离心取上清液，以4ml/min的流速流过xad-16n大孔吸附树脂，再依次用2倍柱体积的体积浓度10％、20％、40％、60％、80％、100％的乙醇，以2ml/min的流速洗脱大孔树脂上吸附的物质，并收集各梯度的洗脱液；
17、步骤(3)中，阴离子交换法分离活性物质的操作步骤为：
18、d.从xad-16n大孔吸附树脂中粗分离获得洗脱液；
19、e.将阴离子交换填料预处理后进行湿法装柱并清洗；
20、f.20mm tris-hcl缓冲液继续冲3-5个柱体积来平衡层析柱；
21、g.平衡后上样品，用缓冲液冲洗掉柱子上未结合杂蛋白，然后用不同梯度的洗脱液进行洗脱：20mm tris-hcl+0.2m氯化钠、20mm tris-hcl+0.5m氯化钠、20mm tris-hcl+1.0m氯化钠，收集各梯度的洗脱液。
22、进一步地，步骤(2)中使用2倍柱体积的体积浓度20％的乙醇进行洗脱；
23、步骤(3)中使用20mm tris-hcl+0.2m氯化钠进行洗脱。
24、进一步地，步骤(4)中，凝胶过滤法分离活性物质的操作步骤为：
25、h.从阴离子交换得到的活性组分浓缩至2ml；
26、i.将sephadex g-75凝胶处理后进行湿法装柱，用超纯水平衡2个以上柱体积；
27、j.平衡后上样品，用缓冲液即超纯水进行洗脱，收集洗脱液。
28、进一步地，步骤(2)中发酵液的制备步骤如下：
29、菌株活化及培养：用接种环从甘油管中取出干酪乳杆菌iob-p9于mrs培养基平板划线，36±2℃，密闭培养20-22h；取单菌落至种子培养基，36±2℃，培养24h得一级种子液，将一级种子液按1％接种量到二级种子培养基，36±2℃，培养24h，将二级种子液按1％接种量到发酵培养基37℃培养48h，收集发酵液上清，得到发酵液；
30、其中，种子培养基为脱脂豆粉40g/l，葡萄糖10g/l，溶剂为水；发酵培养基为高温豆粕90g/l，葡萄糖5g/l，麸皮粉1g/l，溶剂为水。
31、进一步地，步骤(5)包括干酪乳杆菌iob-p9活性成份的初步活性检测，采用滤纸片法测定大孔吸附层析法洗脱液，用牛津杯法测定阴离子交换法洗脱液和凝胶过滤层析法洗脱液，以藤黄八叠球菌作为指示菌；
32、步骤(5)包括干酪乳杆菌iob-p9活性成份的hplc分析：大孔吸附层析体积浓度20％乙醇洗脱液、阴离子交换层析20mm tris-hcl+0.2m氯化钠洗脱液和凝胶过滤层析中活性成份经预处理后置于4℃备用，用流动相a即100％乙腈+0.1％tfa平衡agilent zorbaxnh2色谱柱1小时，直至基线平稳；
33、步骤(5)包括干酪乳杆菌iob-p9活性成份的预处理：将发酵液上清冷冻干燥后，按0.2g/份，称取6份，分别加入水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、丙酮各1ml，混和超声5min，10000r/min离心10分钟；
34、步骤(5)包括干酪乳杆菌iob-p9活性成份的热稳定性进行探究：用25℃、30℃、37℃、60℃、80℃、100℃、115℃、121℃分别水浴处理20min，等冷却至室温，以藤黄八叠球菌作为指示菌；
【技术保护点】
1.一种干酪乳杆菌IOB-P9在制备治疗幽门螺旋杆菌药物中的应用，所述干酪乳杆菌IOB-P9于2021年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.24195。
2.一种干酪乳杆菌IOB-P9在制备抑制和杀灭幽门螺旋杆菌药物中的应用，所述干酪乳杆菌IOB-P9于2021年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.24195。
3.一种干酪乳杆菌IOB-P9抗幽门螺杆菌活性物质分离的制备和分离纯化方法，其特征在于：包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(1)包括：菌种活化和发酵培养，种子的最佳种龄为20-24h，接种量为1％，发酵时间为48h；其中，种子培养基为脱脂豆粉40g/L，葡萄糖10g/L，溶剂为水；发酵培养基为高温豆粕90g/L，葡萄糖5g/L，麸皮粉1g/L，溶剂为水。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中使用2倍柱体积的体积浓度20％的乙醇进行洗脱；>
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，凝胶过滤法分离活性物质的操作步骤为：
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中发酵液的制备步骤如下：
8.根据权利要求4至7任一项所述的方法，其特征在于：步骤(5)包括干酪乳杆菌IOB-P9活性成份的初步活性检测，采用滤纸片法测定大孔吸附层析法洗脱液，用牛津杯法测定阴离子交换法洗脱液和凝胶过滤层析法洗脱液，以藤黄八叠球菌作为指示菌；
9.如权利要求4至8任一项所述的方法制备得到的干酪乳杆菌IOB-P9抗幽门螺杆菌活性物质。
10.如权利要求9所述的干酪乳杆菌IOB-P9抗幽门螺杆菌活性物质在制备抑制幽门螺旋杆菌的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种干酪乳杆菌iob-p9在制备治疗幽门螺旋杆菌药物中的应用，所述干酪乳杆菌iob-p9于2021年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，其保藏编号为cgmcc no.24195。
2.一种干酪乳杆菌iob-p9在制备抑制和杀灭幽门螺旋杆菌药物中的应用，所述干酪乳杆菌iob-p9于2021年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，其保藏编号为cgmcc no.24195。
3.一种干酪乳杆菌iob-p9抗幽门螺杆菌活性物质分离的制备和分离纯化方法，其特征在于：包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(1)包括：菌种活化和发酵培养，种子的最佳种龄为20-24h，接种量为1％，发酵时间为48h；其中，种子培养基为脱脂豆粉40g/l，葡萄糖10g/l，溶剂为水；发酵培养基为高温豆粕90g...
【专利技术属性】
技术研发人员：张会图，吴亚慧，王海宽，梁武，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：
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