【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种口蹄疫假病毒细胞培养系统及其应用。本专利技术属于生物。
技术介绍
1、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，fmdv)是一种具有高度传染性和经济破坏性的小rna病毒，病毒粒子无包膜，具有二十面体对称性，包裹着8.4kb的单链正链rna基因组，口蹄疫病毒基因组含有一个大的开放阅读框，编码八种非结构蛋白和四种结构蛋白：非结构蛋白包括lpro、2a、2b、2c、3a、3b、3c和3d，主要调节口蹄疫病毒的成熟和复制；结构蛋白vp1、vp2、vp3结合形成衣壳表面结构，vp4形成病毒颗粒的内部结构；结构蛋白vp1位于病毒表面，是病毒吸附、内化、复制的关键衣壳蛋白，在病毒对抗宿主免疫系统功能时发挥重要作用，是fmdv重要的抗原位点，也是fmdv变异的关键蛋白。此外，fmdv可通过直接或间接途径迅速传播[6]，其易感动物包括猪、牛、羊等70余种偶蹄类动物。感染后的动物常表现出明显的临床症状，如发热、跛行和唾液分泌异常增多，蹄部出现水疱性病变等，严重影响动物的健康与生产性能。鉴于口蹄疫对畜牧业发展的严重冲击，对国际贸易的阻碍以及对公共卫生安全的潜在威胁，世界动物卫生组织(woah)将其列为必报动物疫病之首，我国将其列为一类动物疫病，并实行强制免疫措施。
2、鉴于fmdv对公共卫生及经济构成的严重威胁，fmdv活病毒的研究必须在生物安全三级实验室(bsl-3)或以上级别实验室中开展以确保安全标准。在高级别生物安全实验室，高致病性病毒实验活动的经济成本和时间成本都很高昂。目前我国现有的
3、trvlp是指具有转录和复制能力的病毒样颗粒[furuyama,wakako et al.“development of an imaging system for visualization of ebola virusglycoprotein throughout the viral lifecycle.”frontiers in microbiologyvol.131026644.3nov.2022,doi:10.3389/fmicb.2022.1026644]，它由一种生物安全二级(bsl-2)细胞培养系统来生产，该系统由两部分组成[wang,zhongyi et al.“a rapidscreen for host-encoded mirnas with inhibitory effects against ebola virususing atranscription-and replication-competent virus-like particle system.”international journal of molecular sciences vol.19,5 1488.16may.2018,doi:10.3390/ijms19051488]：含有核衣壳基因或其他关键基因缺失的基因组病毒rna(复制子)和表达所缺基因蛋白的生产细胞系。trvlp可以实现原病毒粒子完整的病毒生命周期，并且完全局限于产生的细胞。具体来说，trvlp可在包装细胞内繁殖和传代，而在野生型细胞中只能单轮感染，从而实现了一些高致病性病毒的研究工作可进行生物安全降级处理的愿望。trvlp细胞培养系统可用于研究病毒与宿主细胞的相互作用、病毒的细胞嗜性、中和抗体检测及疫苗评价、特异性受体筛选、病毒进入细胞的机制研究、抗病毒药物筛选等，对于新出现以及重新出现的病毒来说是一种非常有用的病毒学工具，它们具有安全性和多功能性的特点。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种口蹄疫假病毒细胞培养系统及其应用，该体系是一种生物安全二级(bsl-2)细胞培养系统，可用于生产具有转录和复制能力的口蹄疫假病毒。
2、为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：
3、本专利技术的一种口蹄疫假病毒细胞培养系统，所述的细胞培养系统由nluc基因替换了口蹄疫病毒衣壳蛋白p1基因的亚基因组复制子fmdv-nluc和稳定整合fmdvp12a3c基因的bhk-21细胞系组成。
4、其中，优选的，所述的口蹄疫病毒为o型fmdv。
5、其中，优选的，所述的nluc基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
6、其中，优选的，所述的亚基因组复制子fmdv-nluc的核苷酸序列如seq idno.3所示。
7、进一步的，本专利技术还提出了所述的口蹄疫假病毒细胞培养系统在生产具有转录和复制能力且不具有活病毒的感染性的口蹄疫假病毒中的应用。
8、再进一步的，本专利技术还提出了一种使用所述的口蹄疫假病毒细胞培养系统生产口蹄疫假病毒的方法，所述的方法包括以下步骤：将所述的nluc基因替换了fmdv衣壳蛋白p1基因的亚基因组复制子转染进稳定整合fmdv p12a3c基因的bhk-21细胞系，当细胞出现fmdv的典型病变，将病变细胞冻融三次，收获fmdv病毒样颗粒，即为所述的口蹄疫假病毒。
9、再进一步的，本专利技术还提出了一种口蹄疫假病毒，所述的口蹄疫假病毒具有转录和复制能力，但不具有活病毒的感染性，所述的口蹄疫假病毒使用所述的口蹄疫假病毒细胞培养系统生产获得。
10、再进一步的，本专利技术还提出了所述的口蹄疫假病毒在制备检测fmdv抗体中的应用。
11、其中，优选的，所述的抗体为抗fmdv中和抗体。
12、相较于现有技术，本专利技术的有益效果是：
13、本专利技术提出了一种口蹄疫假病毒细胞培养系统，还提出了一种在稳定整合fmdvp12a3c基因的bhk-21细胞系中生产fmdv-trvlp的方法，本专利技术以nluc报告基因替换fmdv结构蛋白p1基因，构建含有nluc报告基因的fmdv亚基因组复制子fmdv-nluc。fmdv-trvlps可以在稳定整合fmdv p12a3c基因的bhk-21细胞系中传代，但在其他细胞中只能导致单次感染，实现了生物安全降级。该trvlp体系为更好地了解fmdv的生命周期提供了一个独特的基础研究应用系统。因此，我们还建立了基于fmdv-trvlps的血清中和实验，可为中和抗体的检测提供极大的便利。
14、fmdv-nluc复制子系统的构建，为深入研究fmdv的复制和翻译机制奠定了基础，也为口蹄疫病毒假病毒的构建提供了必要条件。具体而言，构建的fmdv-nluc复制子可以用于以下领域的研究：(1)fmdv复制和翻译调控机制研究，(2)表达nluc的fmdv复制子的进一步改进可作为复制子载体应用于复制子疫苗的研制；(3)用作构建口蹄疫假病毒的口蹄疫复制子本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种口蹄疫假病毒细胞培养系统，其特征在于，所述的细胞培养系统由Nluc基因替换了口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)衣壳蛋白P1基因的亚基因组复制子FMDV-Nluc和稳定整合FMDV P12A3C基因的BHK-21细胞系组成。
2.权利要求1或2所述的口蹄疫假病毒细胞培养系统，其特征在于，所述的口蹄疫病毒为O型口蹄疫病毒。
3.权利要求2所述的口蹄疫假病毒细胞培养系统，其特征在于，所述的Nluc基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.如权利要求1所述的口蹄疫假病毒细胞培养系统，其特征在于，所述的亚基因组复制子FMDV-Nluc的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.权利要求1-4任一项所述的口蹄疫假病毒细胞培养系统在生产具有转录和复制能力且不具有活病毒的感染性的口蹄疫假病毒中的应用。
6.一种使用权利要求1-4任一项所述的口蹄疫假病毒细胞培养系统生产口蹄疫假病毒的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：将所述的Nluc基因替换了FMDV衣壳蛋白P1基
7.一种口蹄疫假病毒，其特征在于，所述的口蹄疫假病毒具有转录和复制能力，但不具有活病毒的感染性，所述的口蹄疫假病毒使用权利要求1-4任一项所述的口蹄疫假病毒细胞培养系统生产获得。
8.权利要求7所述的口蹄疫假病毒在制备检测抗FMDV抗体中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的抗体为抗FMDV的中和抗体。
...【技术特征摘要】
1.一种口蹄疫假病毒细胞培养系统，其特征在于，所述的细胞培养系统由nluc基因替换了口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，fmdv)衣壳蛋白p1基因的亚基因组复制子fmdv-nluc和稳定整合fmdv p12a3c基因的bhk-21细胞系组成。
2.权利要求1或2所述的口蹄疫假病毒细胞培养系统，其特征在于，所述的口蹄疫病毒为o型口蹄疫病毒。
3.权利要求2所述的口蹄疫假病毒细胞培养系统，其特征在于，所述的nluc基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
4.如权利要求1所述的口蹄疫假病毒细胞培养系统，其特征在于，所述的亚基因组复制子fmdv-nluc的核苷酸序列如seq id no.3所示。
5.权利要求1-4任一项所述的口蹄疫假病毒细胞培养系统在生产具有转录和复制能力且...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙世琪，郭慧琛，周海纤，任玫，吴金恩，谭书桢，张韵，董虎，滕志东，白满元，周静静，穆素雨，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心兰州分中心，
类型：发明
国别省市：
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