【技术实现步骤摘要】
本说明书涉及生物，特别涉及一种基于cjcas9的基因编辑系统及其应用。
技术介绍
1、与基因突变相关的疾病往往是难以被治愈的，它们的产生源自于dna上的点突变、片段插入和片段缺失中的一种或几种。crispr系统自诞生以来，已通过多种改造方式用于突变基因的修复。同源定向修复可以在提供外源模板dna的情况下进行基因编辑，但是同源定向修复会引起双链dna断裂，并且编辑效率较低。
2、碱基编辑器可以在不引入双链dna断裂的前提下实现单碱基的编辑，并且通过多种改造不断提高编辑效率。beacon1系统在cas蛋白的n端连接胞苷脱氨酶ha3a，c端连接尿嘧啶糖基化酶ugi，在体外和体内都能诱导较高的编辑效率。
3、先导编辑器是一款无需额外供体模板、不引起双链dna断裂，就能够实现12种单碱基替换以及片段插入和片段缺失的基因编辑工具。先导编辑器使用融合工程化的逆转录酶的spcas9 nickase(h840a)以及pegrna。pegrna的3’端有着能与目标位点结合的primerbinding site(pbs)和引入目的编辑的reverse transcriptase template(rtt)。pe复合物靶向到目标位点后，cas9 nickase切割产生的单链dna与pbs结合，逆转录酶以rtt为模板进行逆转录反应，新合成的3’flap通过dna修复途径整合进目标位点完成编辑。pe2系统在逆转录酶mmlv上引入了5个突变，提高了编辑效率。pe3在pe2的基础上，添加了一条额外的sgrna，引导spcas9h840a
4、streptococcus pyogenes cas9(spcas9)由1368个氨基酸组成，无论是应用于beacon1系统构成胞嘧啶碱基编辑器还是应用于pe系统构成先导编辑器，其大小都超过了腺病毒载体aav的包装大小，为这些高效编辑器的递送提出了考验。campylobacter jejunicas9由984个氨基酸组成，明显小于spcas9。cjcas9使用spacer长度为22nt的sgrna，识别序列为5’-nnnvryac-3’的pam。已有研究表明，cjcas9可以应用于基因表达调控和碱基编辑器。
5、胞嘧啶碱基编辑器beacon1系统有着较高的碱基编辑效率，但是其体积较大。
技术实现思路
1、为了提高使用cjcas9的be系统的编辑效率，我们在cjcas9上引入p47k突变，并将其应用于beacon1系统。为了将cjcas9应用于pe系统，我们在引入p47k突变的基础上，在cjcas9的n端融合dna结合蛋白sso7d；在pegrna的3’端连接rna aptamer；在系统中添加hmlh1dn13等方式进一步提高编辑效率。最后，我们删除了逆转录酶mmlv的rnase h区域，在不影响pe系统编辑效率的前提下进一步缩小了pe系统的尺寸。
2、本申请提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括cjcas9突变体；相对于野生型cjcas9，所述cjcas9突变体包括d8a氨基酸突变位点，并还包括下列突变位点中的任意一个或多个：d829r、p47k、e42k、l50r或a54r；或者，所述cjcas9突变体包括h559a氨基酸突变位点，并还包括下列突变位点中的任意一个或多个：e42k、p47k、d829r、l50r或a54r。
3、本申请还提供一种分离的多核苷酸，其编码上述的融合蛋白。
4、本申请还提供一种构建体，所述构建体含有上述的分离的多核苷酸。
5、本申请还提供一种表达系统，所述表达系统含有上述的构建体或基因组中整合有外源的上述的多核苷酸。
6、本申请还提供一种基因编辑系统，其包括上述的融合蛋白或其编码多核苷酸。
7、本申请还提供一种基因编辑方法，包括将上述的基因编辑系统与靶基因接触以进行基因编辑。
8、本申请还提供一种基因编辑细胞，采用上述的基因编辑方法对细胞进行基因编辑获得。
9、本申请还提供一种基因编辑细胞构建试剂盒，包括上述的基因编辑系统。
10、本申请还提供上述的融合蛋白、分离的多核苷酸、构建体、表达系统或基因编辑系统在非疾病诊断和治疗的基因编辑中的用途。
11、本申请实施例带来的有益效果包括但不限于：(1)beacon1-cjcas9d8a,p47k突变体可以有效地提高c到t的编辑效率。(2)相比于cjpe3，使用bcjpe3将编辑效率平均提高了13.47倍，使用bcjpe3-ms2将编辑效率平均提高了24.42倍，使用bcjpe5将编辑效率平均提高了22.96倍，使用bcjpe5-ms2将编辑效率平均提高了41.44倍。(3)不同版本的bcjpe3δrnh系统可以在维持bcjpe3系统编辑效率的前提下缩小pe系统的尺寸。
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1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括CjCas9突变体；相对于野生型CjCas9，所述CjCas9突变体包括D8A氨基酸突变位点，并还包括下列突变位点中的任意一个或多个：D829R、P47K、E42K、L50R或A54R；
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，相对于野生型CjCas9，所述CjCas9突变体包括以下任一组氨基酸突变位点：D8A和D829R；D8A和P47K；D8A和E42K；D8A、E42K和P47K；D8A、P47K和D829R；D8A、E42K、P47K和D829R；D8A和L50R；D8A和A54R；D8A、P47K和L50R；D8A、P47K和A54R；D8A、P47K、L50R和A54R；D8A、E42K、P47K、L50R、A54R和D829R；P47K和H559A；E42K、P47K和H559A；P47K、H559A和D829R；E42K、P47K、H559A和D829R；P47K、L50R和H559A；P47K、A54R和H559A；P47K、L50R、A54R和H559A；E42K、P47K、L50R、A54R、H559A和D8
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述野生型CjCas9的氨基酸序列如SEQID NO.127所示。
4.如权利要求1-3任一所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括BEACON1、MMLV、sso7d、hMLH1dn和MMLVΔRnH中的至少一种。
5.如权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括BEACON1，所述CjCas9突变体包括D8A突变位点；
6.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白选自以下任意一个：BEACON1-CjCas9D8A；BEACON1-CjCas9D8A,D829R；BEACON1-CjCas9D8A,P47K；BEACON1-CjCas9D8A,L50R；BEACON1-CjCas9D8A,A54R；BEACON1-CjCas9D8A,E42K；BEACON1-CjCas9D8A,E42K,P47K；BEACON1-CjCas9D8A,P47K,D829R；BEACON1-CjCas9D8A,E42K,P47K,D829R；BEACON1-CjCas9D8A,P47K,L50R；
7.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如下任一所示：SEQ ID NO.128、SEQ ID NO.129、SEQ ID NO.141、SEQ ID NO.144、SEQ ID NO.146、SEQID NO.149、SEQ ID NO.150、SEQ ID NO.151、SEQ ID NO.152、SEQ ID NO.153、SEQ IDNO.154、SEQ ID NO.155、SEQ ID NO.156、SEQ ID NO.157、SEQ ID NO.158、SEQ ID NO.159、SEQ ID NO.160、SEQ ID NO.161、SEQ ID NO.162、SEQ ID NO.163、SEQ ID NO.164、SEQ IDNO.165、SEQ ID NO.166、SEQ ID NO.167、SEQ ID NO.168、SEQ ID NO.169、SEQ ID NO.170、SEQ ID NO.171、SEQ ID NO.172或SEQ ID NO.173。
8.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的C末端连接荧光标签，所述荧光标签选自GFP、YFP、CFP、RFP中至少一种，优选的，所述荧光标签为GFP。
9.一种分离的多核苷酸，其特征在于，其编码如权利要求1～8任一权利要求所述的融合蛋白。
10.一种构建体，其特征在于，所述构建体含有如权利要求9所述的分离的多核苷酸。
11.一种表达系统，其特征在于，所述表达系统含有如权利要求10所述的构建体或基因组中整合有外源的如权利要求9所述的多核苷酸。
12.如权利要求11所述的表达系统，其特征在于，所述表达系统的宿主细胞选自真核细胞或原核细胞；优选地，所述宿主细胞选自小鼠细胞、人细胞；更优选的，所述宿主细胞为HEK293。
13.一种基因编辑系统，其包括如权利要求1～8任一权利要求所述的融合蛋白或其编码多核苷酸。
14.如权利要求13所述的基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统还包括sgRNA或其编码多核苷酸。
15.如权利要求14所述的基因编辑系统，其特征在于，所述sgRNA的3’端连接RNAaptamerMS2。...
【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括cjcas9突变体；相对于野生型cjcas9，所述cjcas9突变体包括d8a氨基酸突变位点，并还包括下列突变位点中的任意一个或多个：d829r、p47k、e42k、l50r或a54r；
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，相对于野生型cjcas9，所述cjcas9突变体包括以下任一组氨基酸突变位点：d8a和d829r；d8a和p47k；d8a和e42k；d8a、e42k和p47k；d8a、p47k和d829r；d8a、e42k、p47k和d829r；d8a和l50r；d8a和a54r；d8a、p47k和l50r；d8a、p47k和a54r；d8a、p47k、l50r和a54r；d8a、e42k、p47k、l50r、a54r和d829r；p47k和h559a；e42k、p47k和h559a；p47k、h559a和d829r；e42k、p47k、h559a和d829r；p47k、l50r和h559a；p47k、a54r和h559a；p47k、l50r、a54r和h559a；e42k、p47k、l50r、a54r、h559a和d829r。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述野生型cjcas9的氨基酸序列如seqid no.127所示。
4.如权利要求1-3任一所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括beacon1、mmlv、sso7d、hmlh1dn和mmlvδrnh中的至少一种。
5.如权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括beacon1，所述cjcas9突变体包括d8a突变位点；
6.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白选自以下任意一个：beacon1-cjcas9d8a；beacon1-cjcas9d8a,d829r；beacon1-cjcas9d8a,p47k；beacon1-cjcas9d8a,l50r；beacon1-cjcas9d8a,a54r；beacon1-cjcas9d8a,e42k；beacon1-cjcas9d8a,e42k,p47k；beacon1-cjcas9d8a,p47k,d829r；beacon1-cjcas9d8a,e42k,p47k,d829r；beacon1-cjcas9d8a,p47k,l50r；
7.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如下任一所示：seq id no.128、seq id no.129、seq id no.141、seq id no.144、seq id no.146、seqid no.149、seq id no.150、seq id no.151、seq id no.152、seq id no.153、seq idno.154、seq id no.155、seq id no.156、seq id no.157、seq id no.158、seq id no.159、seq id no.160、seq id no.161、seq id no.162、seq id no.163、seq id no.164、seq idno.165、seq id no.166、seq id no.167、seq id no.168、seq id no.169、seq id no.170、seq id no.171、seq id no.172或seq id no.173。
8.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的c末端连接荧光标签，所述荧光标签选自gfp、yfp、cfp、rfp中至少一种，优选的，所述荧光标签为gfp。
9.一种分离的多核苷酸，其特征在于，其编码如权利要求1～8任一权利要求所述的融合蛋白。
10.一种构建体，其特征在于，所述构建体含有如权利要求9所述的分离的多核苷酸。
11.一种表达系统，其特征在于，所述表达系统含有如权利要求10所述的构建体或基因组中整合有外源的如权利要求9所述的多核苷酸。
12.如权利要求11所述的表达系统，其特征在于，所述表达系统的宿主细胞选自真核细胞或原核细胞；优选地，所述宿主细胞选自小鼠细胞、人细胞；更优选的，所述宿主细胞为hek293。
13.一种基因编辑系统，其包括如权利要求1～8任一权利要求所述的融合蛋白...
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