【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，尤其涉及一种同时靶向gprc5d和cs1的嵌合抗原受体及应用。
技术介绍
1、多发性骨髓瘤(mm，multiple myeloma)是血液学第二大恶性肿瘤，起源于骨髓造血组织的浆细胞恶性增殖，最终导致器官或组织损伤，主要临床表现包括骨骼系统损害、肾脏损害及血液系统损害。在过去的十年中，治疗多发性骨髓瘤的方式大多以综合治疗为主，包括化疗、放疗、自体干细胞移植等。①化疗，包括传统化疗药物(如马法兰、阿霉素和环磷酰胺等)、糖皮质激素(如地塞米松、强的松等)、免疫调节剂(如沙利度胺、来那度胺、泊马度胺等)和蛋白酶抑制剂(如硼替佐米、卡非佐米、伊沙佐米、帕比司他)等；②放疗，用于局限性骨髓瘤、局部骨痛及有脊髓压迫症状者；③自体干细胞移植，通过破坏肿瘤微环境，直接清除骨髓瘤细胞，促进t细胞介导的抗骨髓瘤反应。尽管患者病情也有所改善，但这种疾病仍不可避免的复发。基于mm难以根治易耐药复发的疾病特点，目前的治疗方法远远未满足当前的医疗需求，如何改变难治性复发性多发性骨髓瘤患者的不良生存现状，改善患者的生存质量，仍是亟需解决的难题。
2、2021年3月，百时美施贵宝(bms)bcma靶向car-t细胞疗法abecma(idecabtagenevicleucel，ide-cel)获得美国fda批准，成为全球获批的第一种bcmacar-t细胞疗法：用于治疗既往接受过4种或更多种疗法(包括免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂、抗cd38抗体)的r/rmm成人患者。来自关键2期karmma研究的数据显示，总缓解率(orr)为72
3、虽然，目前已有多款用于mm的cart获批上市，但是缓解率有限，且患者复发率也很高。这可能是因为经过car-t治疗后mm细胞表达的bcma抗原量下降，或者在选择压力下抗原表位发生改变，不再被car-t细胞识别，以及肿瘤细胞的异质性影响。因此，为了提高mm患者生存周期尤其为bcmacar-t治疗后复发的多发性骨髓瘤患者提供有效的治疗手段，提出本专利技术。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术以gprc5d、cs1为双靶点，同时靶向多发性骨髓瘤的两个表面标志物，并对car结构进行优化，不仅可以有效防止因单个靶点丢失导致的肿瘤复发，而且在靶向杀伤多发性骨髓瘤细胞中也表现优异，效果也优于gprc5d-cart、cs1-cart联用，能够有效治疗肿瘤且降低治疗后肿瘤复发率，延长病人生存周期。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种同时靶向gprc5d和cs1的嵌合抗原受体在制备多发性骨髓瘤治疗药物中的应用，所述同时靶向gprc5d和cs1的嵌合抗原受体含有胞膜外抗原结合区，所述胞膜外抗原结合区为通过柔性接头依次串联的gprc5d抗体重链、gprc5d抗体轻链、cs1抗体重链、cs1抗体轻链；
3、所述gprc5d抗体重链的序列如seq id no.1所示，gprc5d抗体轻链的序列如seqid no.2所示，cs1抗体重链的序列如seq id no.3所示，cs1抗体轻链的序列如seq id no.4所示。
4、gprc5d是一种g蛋白偶联孤儿受体，在正常情况下，其表达仅限于毛囊中，在多发性骨髓瘤细胞中特异性高表达于恶性浆细胞，因此是治疗多发性性骨髓瘤的潜在优秀靶点。但gprc5d在正常b细胞和浆细胞上不表达或低表达，所以gprc5d car-t细胞不会攻击正常的b细胞和浆细胞，这点优于bcmacar-t，后者在正常b细胞和浆细胞上也高表达。cs1(也称cd319，slamf7)为信号淋巴细胞活化分子家族成员7，是调节nk细胞免疫功能的表面受体蛋白。cs1在多发性骨髓瘤(mm)细胞系中高度表达，但在健康组织，原发性肿瘤组织或血液学和非血液学癌症细胞系未发现，是治疗多发性骨髓瘤的优秀靶标。但目前尚未有针对这两个靶点进行结合的car-t治疗方法的报道，更没有对其结构的优化以保证协同作用，而且，众所周知，串联car-t细胞治疗策略面临的挑战如设计复杂性、可能的结构优化需求以及对car效力的影响因素(如scfv的顺序、vh和vl的排列、连接体的长度和刚性)等，这可能需要复杂的结构优化和实证测试。
5、本专利技术中，通过对嵌合抗原受体的胞外结构进行筛选获得最优结构，具体为：分别设计胞膜外抗原结合区vh1-vl1-vh2-vl2、vl1-vh1-vh2-vl2、vh1-vl1-vl2-vh2、vl1-vh1-vl2-vh、vh2-vl2-vh1-vl1、vh2-vl2-vl1-vh1、vl2-vh2-vh1-vl1、vl2-vh2-vl1-vh1，其中1为anti-gprc5d scfv，2为anti-cs1 scfv，在相同条件下进行靶细胞裂解的效果对比，发现只有在保外结构为vh1-vl1-vh2-vl2时，裂解效果最优。
6、进一步地，所述柔性接头为(ggggs)n，n选自1-5的整数。
7、进一步地，所述胞膜外抗原结合区的氨基酸序列如seq no.5所示。
8、进一步地，所述嵌合抗原受体还含有胞外信号肽区、铰链区、跨膜区和胞内信号区，所述嵌合抗原受体含有依次串联的胞外信号肽区、胞膜外抗原结合区、铰链区、跨膜区、胞内信号区。
9、进一步地，胞外信号肽的选择可为cd8a信号肽。
10、优选地，所述嵌合抗原受体含有依次串联的cd8a信号肽、胞膜外抗原结合区、cd8铰链区、cd8跨膜区、cd137胞内信号区、cd3zeta胞内信号区。
11、进一步地，所述cd8a信号肽、cd8铰链区、cd8跨膜区、cd137胞内信号区、cd3zeta胞内信号区的氨基酸序列分别如seq id no.6-10所示。
12、进一步地，所述同时靶向gprc5d和cs1的嵌合抗原受体的氨基酸序列如seq idno.11所示，核苷酸序列如seq id no.12所示。
13、进一步地，所述多发性骨髓瘤治疗药物用于治疗多发性骨髓瘤，尤其是bcma表达阴性或bcmacar-t治疗后复发的多发性骨髓瘤。
14、本专利技术的第二个目的是提供一种体外杀伤骨髓瘤细胞的方法，包括将car-t细胞与骨髓瘤细胞共孵育的步骤；
15、其中，car-t细胞中含有同时靶向gprc5d和cs1的嵌合抗原受体，所述同时靶向gprc5d和cs1的嵌合抗原受体含有胞膜外抗原结合区，所述胞膜外抗原结合区为通过柔性接头依次串联的gprc5d抗体重链、gprc5d抗体轻链、cs1抗体重链、cs1抗体轻链，所述gprc5d抗体重链的序列如seq id no.1所示，gprc5d抗体轻链的序列如seq id no.2所示，cs1抗体重链的序列如seq id no.3所示，cs1抗体轻链的序列如seq id no.4所示。
16、进一步地，共孵育时，car-t细胞与骨髓瘤细胞的数量比大于等于1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种同时靶向GPRC5D和CS1的嵌合抗原受体在制备多发性骨髓瘤治疗药物中的应用，其特征在于，所述同时靶向GPRC5D和CS1的嵌合抗原受体含有胞膜外抗原结合区，所述胞膜外抗原结合区为通过柔性接头依次串联的GPRC5D抗体重链、GPRC5D抗体轻链、CS1抗体重链、CS1抗体轻链；
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述胞膜外抗原结合区为依次串联的GPRC5D抗体重链、柔性接头、GPRC5D抗体轻链、柔性接头、CS1抗体重链、柔性接头、CS1抗体轻链；所述柔性接头为(GGGGS)n，n选自1-5的整数。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述嵌合抗原受体还含有胞外信号肽区、铰链区、跨膜区和胞内信号区。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述嵌合抗原受体含有依次串联的CD8a信号肽、胞膜外抗原结合区、CD8铰链区、CD8跨膜区、CD137胞内信号区、CD3zeta胞内信号区；所述胞膜外抗原结合区的氨基酸序列如SEQ NO.5所示，所述CD8a信号肽、CD8铰链区、CD8跨膜区、CD137胞内信号区、CD3zeta胞内信
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ IDNO.11所示；所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
6.一种体外杀伤骨髓瘤细胞的方法，其特征在于，包括将CAR-T细胞与骨髓瘤细胞共孵育的步骤；
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
8.一种同时靶向GPRC5D和CS1的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体含有胞膜外抗原结合区，所述胞膜外抗原结合区为通过柔性接头依次串联的GPRC5D抗体重链、GPRC5D抗体轻链、CS1抗体重链、CS1抗体轻链；
9.编码权利要求8所述嵌合抗原受体的核酸分子、含有所述核酸分子的表达载体或含有所述嵌合抗原受体的重组细胞。
10.一种肿瘤治疗药物，其特征在于，含有权利要求8所述的嵌合抗原受体、或权利要求9所述核酸分子、表达载体或重组细胞。
...【技术特征摘要】
1.一种同时靶向gprc5d和cs1的嵌合抗原受体在制备多发性骨髓瘤治疗药物中的应用，其特征在于，所述同时靶向gprc5d和cs1的嵌合抗原受体含有胞膜外抗原结合区，所述胞膜外抗原结合区为通过柔性接头依次串联的gprc5d抗体重链、gprc5d抗体轻链、cs1抗体重链、cs1抗体轻链；
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述胞膜外抗原结合区为依次串联的gprc5d抗体重链、柔性接头、gprc5d抗体轻链、柔性接头、cs1抗体重链、柔性接头、cs1抗体轻链；所述柔性接头为(ggggs)n，n选自1-5的整数。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述嵌合抗原受体还含有胞外信号肽区、铰链区、跨膜区和胞内信号区。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述嵌合抗原受体含有依次串联的cd8a信号肽、胞膜外抗原结合区、cd8铰链区、cd8跨膜区、cd137胞内信号区、cd3zeta胞内信号区；所述胞膜外抗原结合区的氨基酸序列如seq no.5所示，所述cd8a信号肽、cd8铰链区...
【专利技术属性】
技术研发人员：李俊，黄彤舸，
申请(专利权)人：江苏拓弘康恒医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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