6030442E23Rik条件性基因敲除小鼠模型的构建方法技术

技术编号：44506267 阅读：3 留言：0更新日期：2025-03-07 13:04

本发明专利技术公开了一种6030442E23Rik条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，属于基因工程技术领域，利用同源重组原理，采用受精卵同源重组的方式，对6030442E23Rik基因进行flox修饰。简要过程如下：通过体外转录的方式，获得Cas9mRNA和gRNA；通过In‑Fusion cloning的方法构建同源重组载体(donor vector)，该载体包含2.9kb 5’同源臂、2.2kb的flox区域和2.6kb 3’同源臂。将Cas9mRNA、gRNA和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠，PCR扩增及测序鉴定阳性的F0代小鼠。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程，尤其涉及一种6030442e23rik条件性基因敲除小鼠模型的构建方法。

技术介绍

1、全球日益老龄化社会是世界各地的重大公共卫生挑战之一。衰老是最重要的心血管危险因素，血管衰老是个体衰老过程中的一种结构异常和功能障碍，其特征是血管细胞衰老加剧、血管功能障碍和血管重塑。因此，进一步了解衰老诱导的血管功能障碍的具体分子机制可能为延缓血管衰老和降低与年龄相关的心血管疾病的发病率和死亡率提供新的治疗选择。

2、长链非编码rna(long noncoding rna，lncrna)是一类长度大于200nt的非编码rna，是非编码基因组的重要组成部分。大量研究表明，lncrnas参与了多种生物学过程，包括细胞衰老、dna甲基化、组蛋白修饰、rna转录后调控和蛋白质翻译调控等，并且影响了各种生理和病理过程的调节，是细胞乃至个体调控基因的重要分子。

3、我们前期利用衰老主动脉组织和年轻主动脉组织，结合lncrnaarray技术，筛选出与年龄相关的lncrna——6030442e23rik，并给它命名为“衰老相关转录本”(agingassociatedtranscript，aat)。此外，我们已在小鼠主动脉组织中验证得到，6030442e23rik的表达会随着年龄的增长而不断增加，而6030442e23rik突变后小鼠血管功能改善，能量代谢激活，活动能力增强。

4、总的来说，人同样具有与小鼠同源的aat序列，靶向该序列有望成为延缓血管衰老、改善血管功能的潜在治疗策略。

技术实现思路

1、针对上述存在问题，本专利技术则采用受精卵同源重组的方式，对6030442e23rik基因进行flox修饰，以获得可进行条件性敲除6030442e23rik基因的小鼠模型。

2、本专利技术的目的是提供一种6030442e23rik条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：

3、步骤1：设计识别6030442e23rik基因的grna，进行体外转录，获得cas9mrna和grna；

4、步骤2：构建同源重组载体；

5、步骤3：将cas9 mrna、grna和同源重组载体显微注射到小鼠的受精卵中，获得敲除6030442e23rik基因的小鼠模型。

6、进一步地，步骤1中用于制备grna的引物序列包括grna1和grna2，grna1和grna2的核苷酸序列如下所示：

7、grna1：5'-gccaataaggttttatcagctgg-3'；

8、grna2：5'-gctggagaccttattctattggg-3'。

9、更进一步地，步骤2中同源重组载体包含2.9kb 5’同源臂、2.2kb的flox区域和2.6kb 3’同源臂。

10、更进一步地，用in-fusion cloning方法将5’同源臂、flox区域和3’同源臂的目的片段连接到pbr-322载体上。

11、更进一步地，步骤3中将cas9 mrna、grna和同源重组载体显微注射到小鼠的受精卵中，20天出生的小鼠为f0代小鼠，对f0代小鼠进行pcr鉴定，得到阳性f0代小鼠，即为敲除6030442e23rik基因的小鼠模型。

12、更进一步地，f0代小鼠鉴定方案如下：

13、5’臂同源重组阳性基因组应扩增出5.4kb片段，阴性基因组应扩增出8.3kb片段；3’臂同源重组阳性基因组应扩增出5.7kb片段，阴性基因组应扩增出9.4kb片段。

14、更进一步地，5’同源臂的pcr引物序列如下所示：

15、forward-ggcatggtaaaggattcacatcaaa；

16、reverse-tacactcttgatgctttgggttttc。

17、更进一步地，3’同源臂的pcr引物序列如下所示：

18、forward-tcctgtgttgacatagttctttgga；

19、reverse-tgtcatgtttacctctccagacatt。

20、更进一步地，小鼠为c57bl/6j小鼠。

21、与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：

22、本申请构建的6030442e23rik基因条件性敲除小鼠模型重复性高、可控性好，易于饲养繁殖，且更加稳定、更符合临床特点，为血管衰老相关心脑血管疾病的发生机制研究以及干预措施的探索提供更好的平台。利用该模型对于血管衰老发病机制以及药物治疗和药物筛选的研究将进一步深入且更加科学。

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【技术保护点】

1.6030442E23Rik条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的6030442E23Rik条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤1中用于制备gRNA的引物序列包括gRNA1和gRNA2，gRNA1和gRNA2的核苷酸序列如下所示：

3.根据权利要求2所述的6030442E23Rik条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤2中同源重组载体包含2.9kb 5’同源臂、2.2kb的flox区域和2.6kb 3’同源臂。

4.根据权利要求3所述的6030442E23Rik条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，同源重组载体的构建方法包括：用In-fusion cloning方法将5’同源臂、flox区域和3’同源臂的目的片段连接到pBR-322载体上。

5.根据权利要求4所述的6030442E23Rik条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，F0代小鼠鉴定方案如下：

6.根据权利要求5所述的6030442E23Rik条件性基因敲除小鼠模型的构建

7.根据权利要求6所述的6030442E23Rik条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，3’同源臂的PCR引物序列如下所示：

8.根据权利要求7所述的6030442E23Rik条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，小鼠为C57BL/6J小鼠。

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【技术特征摘要】

1.6030442e23rik条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的6030442e23rik条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤1中用于制备grna的引物序列包括grna1和grna2，grna1和grna2的核苷酸序列如下所示：

3.根据权利要求2所述的6030442e23rik条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤2中同源重组载体包含2.9kb 5’同源臂、2.2kb的flox区域和2.6kb 3’同源臂。

4.根据权利要求3所述的6030442e23rik条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，同源重组载体的构建方法包括：用in-fus...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶军，丘雨旻，夏文豪，
申请(专利权)人：中山大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：

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