【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，更具体地说，它涉及人脐带间充质干细胞外泌体在促进肺发育中的应用及验证方法。
技术介绍
1、支气管肺发育不良(bpd)是早产儿中最常见且严重的慢性肺病，尤其是在胎龄小于28周的极早产儿中。随着医疗技术的进步，新型bpd的病理特征发生了变化，从早期与机械通气和氧疗相关的肺损伤，转变为以肺泡结构简化、肺泡数量减少、毛细血管发育异常和肺实质发育受损为主要特征的疾病。因此，现有的传统治疗手段在新型bpd中的效果有限，新的治疗方法亟需关注如何促进肺发育和修复。
2、在人类肺中，肺泡ii型上皮细胞(at2细胞)是具有自我更新和分化潜力的关键肺泡细胞亚型，在bpd的发生和修复过程中起重要作用。at2细胞不仅能分泌肺表面活性物质，维持肺泡张力，还能在肺泡损伤后分化为肺泡i型细胞，参与肺组织的再生。因此，促进at2细胞的功能恢复和分化，对于改善bpd患儿的肺发育至关重要。
3、在过去的十年中，干细胞疗法，尤其是人脐带间充质干细胞(huc-mscs)，在促进组织修复和发育方面展现出了显著的治疗潜力。huc-mscs来源的外泌体(huc-mscs-exos)作为干细胞旁分泌效应的介质，因其含有多种生长因子、细胞因子、微小rna和蛋白质，能够在组织修复过程中发挥重要作用。外泌体是由双层脂质膜包裹的小囊泡，携带供体细胞的特定活性成分，可以通过调节细胞间的信号传导，影响靶细胞的功能。但是尚无报道人脐带间充质干细胞外泌体具有促进肺发育的功效，尤其是针对早产引起的支气管肺发育不良的报道。
1、本专利技术的目的是提供人脐带间充质干细胞外泌体在促进肺发育中的应用及验证方法，以解决现有技术中针对早产引起的支气管肺发育不良缺乏有效治疗手段以及人脐带间充质干细胞外泌体在促进肺发育的机制尚未得到充分研究等问题。
2、本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：人脐带间充质干细胞外泌体在促进肺发育中的应用，所述人脐带间充质干细胞外泌体的制备过程包括以下步骤：
3、脐带清洁和组织切块：用dulbecco's磷酸盐缓冲液清洁脐带，纵向切开，去除动脉和静脉，将软凝胶组织切成1-3mm3的小块；
4、人脐带间充质干细胞hucmscs培养：将组织块置于6孔板中，用含有10％胎牛血清和青霉素/链霉素的改良鹰氏培养基-α在37℃、5％co2的条件下孵育10-12天，去除脐带组织后维持培养；
5、无血清培养基处理：将培养的hucmscs在无血清培养基中维持48小时；
6、差速离心：依次顺序差速离心去除细胞、细胞碎片和凋亡残留物；
7、超速离心：以120000×g的速度进行1.5小时和2小时的超速离心，收集外泌体沉淀；
8、外泌体沉淀收集与悬浮：将所述外泌体沉淀重新悬浮于200μl的dulbecco's磷酸盐缓冲液中，供后续研究使用。
9、其中，所述维持培养的具体方法为在定期更换培养基并去除脐带组织后，继续用改良鹰氏培养基-α维持培养，直到细胞扩增到3-5代，将人脐带间充质干细胞扩增至10层的细胞培养室。
10、其中，所述差速离心步骤中去除细胞、细胞碎片和凋亡残留物具体离心的过程如下：750g离心力离心10分钟，3000g离心力离心20分钟，12000g离心力离心45分钟。
11、本专利技术另一目的是提供一种上述的人脐带间充质干细胞外泌体在促进肺发育中的应用，所述人脐带间充质干细胞外泌体的鉴定方法是通过透射电子显微镜、纳米粒子跟踪分析和纳米流式技术进行鉴定，所述纳米流式技术分析外泌体蛋白标记物的表达情况，具体表达包括以下：cd9、cd63、cd81表达阳性；所述透射电子显微镜用于观察人脐带间充质干细胞的外泌体形态特征。
12、其中，所述透射电子显微镜观察的具体步骤如下：
13、固定：样品先用2.5％戊二醛预固定，然后用1％的四氧化锇后固定；
14、脱水：样品逐步用丙酮脱水，脱水剂浓度梯度为30％→50％→70％→80％→90％→95％→100％；
15、渗透：将脱水剂和epon-812包埋介质按3:1、1:1和1:3的比例混合，依次渗透；
16、包埋：样品用纯epon-812包埋介质包埋；
17、半薄定位和超薄切片：在光镜下选择小鼠肺组织肺泡区域，用超薄切片机切割60～90nm的超薄切片，并收集在铜网上；
18、染色：切片先用乌洛托品酸盐染色10～15分钟，然后用柠檬酸铅染色1～2分钟。
19、本专利技术进一步设置为：所述人脐带间充质干细胞外泌体通过促进相关蛋白的表达进而促进肺发育，所述蛋白包括成熟的肺泡蛋白spb、spc以及atp结合盒转运蛋白a3。
20、本专利技术进一步设置为：足月婴儿脐带间充质干细胞外泌体相比于早产婴儿脐带间充质干细胞外泌体可以通过调控wnt5a/rock1途径促进rhoa的表达来加速肺发育进程。
21、其中，所述wnt5a/rock1途径具体为足月婴儿脐带间充质干细胞外泌体通过自然富集的wnt5a直接调节肺组织中rock1的磷酸化，促进肺泡ⅱ型细胞的自噬和板层小体的发展，促进肺泡化并降低早产儿bpd的发病率。
22、通过采用上述技术方案，本专利技术发现足月婴儿脐带间充质干细胞外泌体通过富含wnt5a，激活非典型wnt信号途径，特别是wnt5a/rock1途径，促进了肺泡ⅱ型细胞的分化、迁移及自我修复能力，wnt5a直接与rock1相互作用，通过磷酸化rock1，加速肌动蛋白细胞骨架重组，进一步增强肺泡形成和成熟的过程；
23、足月婴儿脐带间充质干细胞外泌体通过促进lbs的形成及其相关蛋白(spc、spb、abca3)的表达，加速了肺泡表面活性剂的合成，表面活性剂的增加能够有效维持肺泡的表面张力，防止肺泡塌陷，并维持肺泡的正常结构与功能，这对于早产儿的肺发育尤为重要；
24、足月婴儿脐带间充质干细胞外泌体通过改善rhoa的表达，增强了自噬相关蛋白lc3b的表达，促进了at2细胞自噬过程中的lbs发育，有助于肺泡细胞稳定性和肺表面活性剂的生成，自噬增强与lbs形成紧密相关，表明足月exos通过rhoa及自噬机制进一步促进了肺的发育和成熟。
25、足月婴儿脐带间充质干细胞外泌体通过改善肺泡化、加速肺泡成熟及促进表面活性剂的合成，为早产儿呼吸问题，尤其是支气管肺发育不良(bpd)的治疗提供了新思路和潜在疗法。这一机制减少了药物副作用，并增强了肺组织自我修复能力，使早产儿更快地恢复正常肺功能。
26、综上所述，本专利技术具有以下有益效果：
27、1.本专利技术的人脐带间充质干细胞外泌体通过其富含的wnt5a显著促进了肺泡化的过程，加速了肺泡的发育和成熟，改善了肺泡结构和肺功能，该作用对早产儿的肺部发育及呼吸问题提供了有效的干预手段；人脐带间充质干细胞外泌体通过激活wnt5a/rock1途径，增强了肺泡上皮细胞的分化和本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.人脐带间充质干细胞外泌体在促进肺发育中的应用，其特征是：所述人脐带间充质干细胞外泌体的制备过程包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞外泌体在促进肺发育中的应用，其特征是：所述维持培养的具体方法为在定期更换培养基并去除脐带组织后，继续用改良鹰氏培养基-α维持培养，直到细胞扩增到3-5代，将人脐带间充质干细胞扩增至10层的细胞培养室。
3.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞外泌体在促进肺发育中的应用，其特征是：所述差速离心步骤中去除细胞、细胞碎片和凋亡残留物具体离心的过程如下：750g离心力离心10分钟，3000g离心力离心20分钟，12000g离心力离心45分钟。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的人脐带间充质干细胞外泌体在促进肺发育中的应用，其特征是：所述人脐带间充质干细胞外泌体的鉴定方法是通过透射电子显微镜、纳米粒子跟踪分析和纳米流式技术进行鉴定，所述纳米流式技术分析外泌体蛋白标记物的表达情况，具体表达包括以下：CD9、CD63、CD81表达阳性；所述透射电子显微镜用于观察人脐带间充质干细胞的外泌体形态特征。p>
5.根据权利要求4所述的人脐带间充质干细胞外泌体在促进肺发育中的应用，其特征是：所述透射电子显微镜观察的具体步骤如下：
6.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞外泌体在促进肺发育中的应用，其特征是：所述人脐带间充质干细胞外泌体通过促进相关蛋白的表达进而促进肺发育，所述蛋白包括成熟的肺泡蛋白SPB、SPC以及ATP结合盒转运蛋白A3。
7.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞外泌体在促进肺发育中的应用，其特征是：足月婴儿脐带间充质干细胞外泌体相比于早产婴儿脐带间充质干细胞外泌体可以通过调控Wnt5a/ROCK1轴促进RhoA的表达来加速肺发育进程。
8.根据权利要求7所述的人脐带间充质干细胞外泌体在促进肺发育中的应用及验证方法，其特征是：所述Wnt5a/ROCK1途径具体为足月婴儿脐带间充质干细胞外泌体通过自然富集的Wnt5a直接调节肺组织中ROCK1的磷酸化，促进肺泡Ⅱ型细胞的自噬和板层小体的发展，促进肺泡化并降低早产儿BPD的发病率。
...【技术特征摘要】
1.人脐带间充质干细胞外泌体在促进肺发育中的应用，其特征是：所述人脐带间充质干细胞外泌体的制备过程包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞外泌体在促进肺发育中的应用，其特征是：所述维持培养的具体方法为在定期更换培养基并去除脐带组织后，继续用改良鹰氏培养基-α维持培养，直到细胞扩增到3-5代，将人脐带间充质干细胞扩增至10层的细胞培养室。
3.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞外泌体在促进肺发育中的应用，其特征是：所述差速离心步骤中去除细胞、细胞碎片和凋亡残留物具体离心的过程如下：750g离心力离心10分钟，3000g离心力离心20分钟，12000g离心力离心45分钟。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的人脐带间充质干细胞外泌体在促进肺发育中的应用，其特征是：所述人脐带间充质干细胞外泌体的鉴定方法是通过透射电子显微镜、纳米粒子跟踪分析和纳米流式技术进行鉴定，所述纳米流式技术分析外泌体蛋白标记物的表达情况，具体表达包括以下：cd9、cd63、cd81表达阳性；所述透射电子显微镜...
【专利技术属性】
技术研发人员：李欣，张海洋，刘瀚旻，母得志，唐军，
申请(专利权)人：四川大学华西第二医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。