本发明专利技术提供了具有全长抗肌萎缩蛋白基因的基本生物功能的新的抗肌萎缩蛋白小／微－基因。尤其是，本发明专利技术提供了一系列合成小／微－抗肌萎缩蛋白基因，其可修复肌纤维膜中的神经元型一氧化氮合酶（ｎＮＯＳ）。本发明专利技术还提供了治疗杜兴氏肌肉萎缩症（ＤＭＤ），贝克尔肌肉萎缩症（ＢＭＤ）和Ｘ染色体关联的扩张型心肌病（ＸＬＤＣ）的方法以及药物组合物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及新的抗肌萎縮蛋白小/微-基因，其保留有全长抗肌萎縮蛋白基因的 基本生物功能。尤其是，本专利技术提供了一系列合成小/微-抗肌萎縮蛋白基因，其可修复肌 纤维膜中的神经元型一氧化氮合酶(nN0S)。
技术介绍
抗肌萎縮蛋白缺陷性疾病包括杜兴氏肌肉萎縮症(Duchenne muscular dystrophy, DMD)，贝克尔肌肉萎縮症(Becker Muscular Dystrophy, BMD)和X染色体关联 的扩张型心肌病(X-linked Dilated Cardiomyopathy, XLDC)。它们都是非常常见的遗传 疾病，在每3， 000个新生儿中就有不止一名男婴患病。进行性肌肉退化及衰弱通常使病人 在十几岁出头时就坐上轮椅，二十岁出头时就过世。女性携带者通常在四五十岁时也会患 病。以上提到的肌肉疾病都是由于抗肌萎縮蛋白基因突变引起，特别是由于x染色体关联 的隐性突变引起。抗肌萎縮蛋白基因是至今所知的最大基因，在x染色体上有近240万个 碱基对，79个外显子，约11. 5kb长的编码序列，并且具有很高的自发性突变率。 目前对于抗肌萎縮蛋白缺陷性疾病并无有效的治疗方法。已经开发出包括细胞 治疗与基因治疗在内的新的遗传学方法。但是，抗肌萎縮蛋白基因的庞大体积与mRNA(14 个千碱基；kb)是基因治疗发展上难以克服的障碍。因此，研究的焦点集中在开发简縮 版的小-抗肌萎縮蛋白基因或微-抗肌萎縮蛋白基因。可以通过病毒载体(例如腺相 关病毒载体(AAV载体)和慢病毒载体)或通过干细胞(例如与血管生成相关的干细胞 (mesoangioblasts)， CD133+干细胞和侧群细胞)导入这些縮短的基因(Yuasa et al.， 1998 ;Wang et al. ，2000 ;Ferrer et al. ，2000 ;Harper et al. ，2002 ;Fabb et al. ，2002 ; Sakamoto et al. ， 2002 ;Bachrach et al. ， 2004 ;S咖paolesi etal. ， 2006 ;Benchaouir et al 2007， Cell Stem Cell 1:646-657)。微基因一般是指自然产生的以及合成的抗肌 萎縮蛋白基因，其具有等于或小于5kb长的编码序列并可被包装至一个单腺相关病毒载体 (AAV)内。小基因是指合成抗肌萎縮蛋白基因，其具有等于或小于10kb，但大于5kb长的编 码序列。小基因不能被包装至一个单AAV载体内，但可以通过变异的双载体进行传递，例如 重叠载体(overlapping vector)，反式剪接载体及杂交载体。 野生型抗肌萎縮蛋白基因具有两个主要的生物功能。 一是可提供细胞骨架与细胞外基质之间的机械连接，以使肌膜在收縮时保持稳定。另一个是可为许多重要的细胞活动 提供信号传导功能。抗肌萎縮蛋白的信号传导功能主要通过被称为神经元型一氧化氮合酶 (nN0S) (Rando，2001)的伴侣(partner)蛋白而完成。多项研究显示，可通过全长抗肌萎縮 蛋白可将nNOS招募至肌纤维膜中(Brenman et al. ， 1995 ;Brenman et al. ， 1996)。最近 的研究进一步显示，在匿D的动物模型和人类病人中，抗肌萎縮蛋白缺陷的肌肉中nNOS的 丧失显著促成了疾病的发展(Bre丽n et al. ，1995 ;Chang et al. ，1996 ;Thomas et al.，1998 ;Sander et al. ，2000)。此外，nNOS的转基因过表达在DMD mdx小鼠模型中可改善 肌肉病理(Wehling et al. ， 2001 ;Tidball and Wehling-Henricks， 2004 ;Shiao et al.，2004 ;Wehling-Henricks et al. ，2005)。 对生成抗肌萎縮蛋白小基因与微基因的尝试已有记载。例如，AR4-R23/AC微抗 肌萎縮蛋白可减少匿D小鼠模型的组织病理。但是，此微-蛋白不能将肌肉比力(specific force)恢复到正常水平(Harper et al， 2002 ;Gregorevic et al.，2004;Liu et al.，2005 ;Yue et al. ， 2006 ;Gregorevic et al.，2006)。 A H2-R19小-抗肌萎縮蛋白基因来 自于一个病情非常轻微的病人(England et al. ， 1990 ;Harper et al. ，2002)。这个小基 因优于AR4-R23微基因或AR4-R23/AC微基因，因为它可以将肌肉比力恢复到与全长抗 肌萎縮蛋白基因相同的水平(Harper et al. ，2002;Lai et al. ，2005)。但是，该小基因 不能修复nNOS。事实上，现有的小-或微-抗肌萎縮蛋白基因均不能在肌纤维膜中招募 nNOS (表一 )(Chao et al. ， 1996 ;Crawford et al. ， 2000 ;War證et al. ， 2002 ;Wells et al. ，2003 ;Torelli et al. ，2004 ;Lai et al. ，2005 ;Yue et al. ，2006 ;Li et al. ，2006 ; Judge et al. ，2006)。无法修复肌纤维膜中的nNOS将显著降低縮小的抗肌萎縮蛋白基因 的疗效。 以前人们认为可通过抗肌萎縮蛋白的C端结构域将nNOS招募至肌纤维膜中 (Bre丽net al. ， 1995 ;Brenman et al. ， 1996)。全长抗肌萎縮蛋白有四个结构域，包括 N端结构域，中部杆状(mid-rod)结构域，富含半胱氨酸的结构域以及C端结构域。N端 结构域和部分中部杆状结构域与细胞骨架F肌动蛋白相互作用。中部杆状结构域含有24 个类血影蛋白重复单位及4个铰链。富含半胱氨酸的结构域与跨膜肌营养不良蛋白聚糖 (dystroglycan)有相互作用，将抗肌萎縮蛋白与细胞外基质连接。C端结构域含有两个互 生蛋白(syntrophin)结合位点与一个异连蛋白(dystrobrevin)结合位点。多项研究显示， 通过nNOS与a -互生蛋白间的PDZ/PDZ结构域的相互作用，可将nNOS被招募至肌纤维膜 中(Bre丽n et al. ，1996 ;Hillier et al. ，1999 ;Kameya et al. ，1999 ;Tochio et al.，1999 ;Adams et al. ，2001 ;Miyagoe-Suzuki and Takeda， 2001)。这似乎显示了一个具有C 端结构域的小_或微_基因应该能够在肌纤维膜中招募nN0S。但是，研究已重复显示，虽然 在这些情况下互生蛋白很好地集中在肌纤维膜内，但现有的含有C端结构域的小/微_抗 肌萎縮蛋白仍无法将nNOS带入肌纤维膜中(Chao et al. ， 1996 ;Lai et al. ，2005)。此 外，研究已显示C端截断的全长抗肌萎縮蛋白可将nNOS招募至肌纤维膜(Cra本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的核酸分子，其含有一核苷酸序列，该序列编码一衍生自全长野生型抗肌萎缩蛋白的修饰蛋白，其中该修饰蛋白含有，从Ｎ端到Ｃ端： （１）抗肌萎缩蛋白的Ｎ端结构域或抗肌萎缩蛋白的修饰的Ｎ端结构域； （２）抗肌萎缩蛋白的中部杆状结构域的至少两个重复单位，其中所述至少两个重复单位包括Ｒ１６和Ｒ１７； （３）抗肌萎缩蛋白的至少两个铰链区，其中所述至少两个铰链区包括Ｈ１和Ｈ４；以及 （４）抗肌萎缩蛋白的富含半胱氨酸的结构域。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：段东升，赖毅，岳永平，
申请(专利权)人：密苏里哥伦比亚大学，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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