【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及三阴性乳腺癌，具体涉及一种具有调控三阴性乳腺癌circmkln1环状rna的筛选及验证方法。
技术介绍
1、世界卫生组织国际癌症研究机构发布的2020年最新癌症数据统计显示，乳腺癌代替肺癌，成为全球第一大癌。三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,tnbc)是乳腺癌中侵袭性最强、危害性最大的恶性肿瘤。虽然局部手术和全身化疗、放疗延长了tnbc患者的总生存期，但tnbc患者的复发率和致死率仍然很高。tnbc是雌激素受体、孕激素受体及人类上皮细胞生长因子受体2均无表达的一类乳腺癌，具有发病低龄化、恶性程度高，侵袭性强，治疗棘手及易复发等明显特质，同时目前仍没有特异性及灵敏度均较高的肿瘤标志物及分子靶向治疗靶点。环状rna(circrnas)是一种新型的内源性非编码rna及新型调控分子，广泛表达于各种生物体的真核转录组中。其特有的环状结构赋予其结构比线性rna稳定、对核酸酶不敏感、保守性、组织表达特异性等性能，使其成为近年rna领域研究的新热点。circrnas与许多疾病，尤其是恶性肿瘤的发生、发展密切相关，并起着重要的调控作用，有望成为乳腺癌疾病的新型生物标记物和潜在治疗靶点，为肿瘤的诊断和靶向治疗提供新的思路。前期我们对环状rna的发展历程、产生机制、分类及生物学功能，及其在乳腺癌早期筛查、诊断和其作用机制的研究进展进行了全面综述，后期为乳腺癌的早期预测、诊断、治疗及研究提供新的方向。
2、随着rna-seq分析技术和生物信息学的不断发展，越来越多的circrnas在tn
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供了一种具有调控三阴性乳腺癌circmkln1环状rna的筛选及验证方法。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：
3、一种具有调控三阴性乳腺癌circmkln1环状rna的筛选及验证方法，该方法包括如下步骤：
4、1)细胞培养
5、人乳腺癌细胞系mda-mb-436使用dmem高糖培养基培养；人乳腺癌细胞系bt-549使用rpmi 1640培养基；所有细胞均培养在37℃、5％co2的湿润的细胞恒温培养箱中；
6、2)细胞rna的提取、逆转录及实时荧光定量pcr；
7、3)pcr扩增及琼脂糖凝胶电泳
8、3.1)pcr扩增
9、利用mda-mb-436和bt-549的cdna和gdna作为模板；所需的发散引物(divergentprimer,dp)和收敛引物(convergent primer,cp)序列见下表：
10、
11、3.2)琼脂糖凝胶电泳
12、将琼脂糖预制胶放入电泳槽内，随后加入相应量的1×tae缓冲液，使其浸没预制胶；在预制胶的第一个上样孔中加入5ul 100bp dna marker，设置电压150v，开始电泳；当指示剂到达离凝胶底部约1cm时停止电泳；用凝胶成像仪观察扩增产物的条带位置；
13、4)sanger测序
14、在凝胶成像仪下切取目标产物条带处的凝胶，随后提取凝胶中目标产物的dna；将洗脱dna送生工生物公司进行sanger测序；
15、5)rnase r酶消化和放线菌素d实验
16、5.1)rnase r酶消化实验
17、(1)为了验证circmkln1对核酸外切酶rnase r不敏感，在提取了tnbc细胞的总rna后，将rna分为实验组和对照组配置反应体系，实验组添加0.1ulrnase r；
18、(2)将两组放入pcr仪中，程序设置为37℃10min，70℃10min；
19、(3)进行逆转录及rt-qpcr实验检测rna水平的变化；
20、5.2)放线菌素d实验
21、使用actd处理细胞抑制细胞内rna的合成过程，以检测circmkln1及其线性rna的半衰期，以验证circmkln1是否具有更高的稳定性；
22、6)circmkln1亚细胞定位的验证
23、6.1)核质分离实验
24、细胞质和细胞核rna提取试剂盒进行
25、(1)准备工作：
26、a)通过向每1ml所需的lysis buffer j中加入10μlβ-巯基乙醇来制备适量的lysis buffer j；使用前将溶液放在冰上或4℃；
27、b)通过向1ml所需的buffer sk中添加10μl的β-巯基乙醇来制备适量的buffersk；
28、c)通过向每个装有wash solution a的瓶子中添加90ml无水乙醇来制备washsolution a的工作浓度；最终体积为128ml；
29、d)在开始前，确保把lysis buffer j放在-20℃的冰箱中10到15分钟，并在使用前取出；
30、(2)细胞组分的制备
31、a)将细胞悬液转移至无rnase的试管，并以不超过200xg或2000rpm的速度离心10分钟以沉淀细胞；
32、b)小心倒出上清液；为了确保沉淀物不会脱落，可能会在沉淀物中留下几微升的培养基；
33、c)在沉淀中加入200ul冰冷的lysis buffer j；
34、d)通过涡旋15秒来裂解细胞；在进行下一步之前，请确保整个沉淀完全溶解；使用移液器将裂解液转移至无rnase的微量离心管；
35、e)在台式离心机中以最大速度旋转裂解液10分钟；
36、f)使用带有小枪头的移液器，将包含细胞质rna的上清液转移至另一个无rnase的试管；
37、(3)将细胞质rna与柱结合
38、a)向前一步的上清液(细胞质rna组分)中加入200ul buffer sk；涡旋混合10秒钟；
39、b)向混合物中加入200ul 96-100％乙醇；涡旋混合10秒钟；
40、c)将混合物加到已与收集管组装在一起的离心柱上，并以3500g或6000rpm离心1分钟；
41、d)丢弃流通液，重新组装离心柱及其收集管；
42、(4)将细胞核rna与柱结合
43、a)将400ul buffer sk添加到沉本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种具有调控三阴性乳腺癌circMKLN1环状RNA的筛选及验证方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的具有调控三阴性乳腺癌circMKLN1环状RNA的筛选及验证方法，其特征在于，步骤5.2)中，使用ActD处理细胞抑制细胞内RNA的合成过程，以检测circMKLN1及其线性RNA的半衰期，以验证circMKLN1是否具有更高的稳定性；具体为：
【技术特征摘要】
1.一种具有调控三阴性乳腺癌circmkln1环状rna的筛选及验证方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的具有调控三阴性乳腺癌circmkln1环状rna的...
【专利技术属性】
技术研发人员：李丽仙，高余翟，林红，陈万一，唐甜甜，黄雨欣，刘洋，时春节，秦晚霞，
申请(专利权)人：重庆大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：
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