【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学(ipc分类号：c12q)，尤其涉及一种无需获取淋巴瘤组织样本检测ctdna的方法及应用。
技术介绍
1、淋巴瘤是中国最常见的恶性肿瘤之一，每年约有10万例新发淋巴瘤患者。淋巴瘤可以原发于身体的任何器官和组织，通常分原发淋巴结和淋巴结外两大类；最常见的表现为无痛性的进行性淋巴结肿大。一方面，对于非浅表性淋巴结病灶，或者无法切除淋巴瘤病灶的患者，例如中枢神经系统淋巴瘤，存在治疗后肿瘤组织样本通常难以获得的技术问题。另一方面，淋巴瘤的疗效评估的最常用的方法是pet-ct(正电子发射计算机断层显像)影像学评估。但是pet-ct具有放射性，患者不能频繁进行pet-ct扫描；且pet-ct对于治疗后的微小残留病灶监测的灵敏度也并不能满足需求。
2、目前常见的循环肿瘤dna(ctdna,circulating tumor dna)检测方法为肿瘤知情法(tumor-informed assay)，需要首先对肿瘤组织进行二代测序，鉴定肿瘤细胞中的基因突变，且通过口腔黏膜样本过滤胚系突变，然后再在血浆游离dna样本中，监测肿瘤的这些突变位点，并计算出ctdna当量。对于难以获取肿瘤组织样本的患者，基于肿瘤知情法的ctdna检测则难以进行。因此，一种不依赖于淋巴瘤肿瘤组织样本的ctdna检测方法，可以有效弥补当前肿瘤知情法的ctdna检测技术的不足。
3、现有技术尝试用外周血样本进行ctdna检测。但是在血浆cfdna(游离dna)样本中，来自肿瘤细胞的ctdna占比相对较少，这对微量ctdna的突变位
4、中国专利cn114446386a公开了一种血液ctdna的检测方法，通过设计能够富集ctdna突变信号的捕获器catcher，并通过拟合健康人的血液背景分布，来确定chv等良性突变频发的基因组区域，同时捕获肺癌、乳腺癌等在内的多种恶性肿瘤的ctdna，提高ctdna的临床适用性。中国专利cn116157539a公开了循环肿瘤核酸分子的多模态分析，通过向样品添加第一量的至少一部分是甲基化的填充dna，然后进一步使样品变性，使用对甲基化多核苷酸具有选择性的结合物捕获无细胞甲基化dna，再对捕获的无细胞甲基化dna进行测序、分析结果，确定了检测癌细胞中ctdna的方法。但是这些现有技术仍然存在着检测结果不够准确，或灵敏度低，或操作繁琐不易实施等缺陷，均未解决上述技术问题。
5、基于上述背景，基于外周血样本的高灵敏度ctdna的检测可以作为淋巴瘤疗效评估的一种有效补充手段，值得重点研究。
技术实现思路
1、本专利技术基于二代测序技术，不需要获取肿瘤组织样本，只通过采集淋巴瘤患者外周血样本，即可检测确定ctdna含量，结合ctdna含量值和治疗过程中的当量值倍数变化，即可预测患者治疗的效果。
2、本专利技术第一方面提供了一种无需获取淋巴瘤组织样本检测ctdna的方法，包括如下步骤：
3、一、收集血液样本；
4、二、构建杂交文库；
5、三、生物信息学分析。
6、优选的，所述血液样本来源于外周血，通过对外周血进行采集、离心、分离，分别得到血浆样本和白细胞样本。
7、优选的，所述外周血包括静脉血、动脉血、毛细血管血；进一步优选为静脉血。
8、优选的，所述步骤一包括：采集血液样本，1000-4000rpm条件下离心5-15min，收集上层液体，即为血浆样本；收集下层细胞，去除红细胞，得到白细胞样本。(参见图1)
9、本专利技术提供的检测ctdna的方法，核心优势在于不需要获取肿瘤组织样本，只通过采集淋巴瘤患者外周血样本，对血液样本进行离心、分离，分别获取血浆样本和白细胞样本，由血浆样本获得cfdna信息，并基于白细胞gdna样本获得胚系突变、chip突变等基底信息，去噪后即可确定样本的ctdna当量；且结合ctdna含量值和治疗过程中的当量值倍数变化，能够预测治疗效果。相比于现有的ctdna检测方法，本专利技术不仅解决了传统肿瘤知情法在实际操作时肿瘤组织样本难以获取的问题，简化了采样操作。本专利技术进一步优选样本为静脉血，样本容易获取且血浆冻存不影响实验结果，易于快捷、批量操作，极大程度上提升了检测方法的可实施性。
10、优选的，所述步骤二包括：s1.构建白细胞基因组dna杂交文库；s2.构建cfdna杂交文库；s3.杂交捕获。
11、优选的，所述s1步骤中，白细胞基因组dna杂交文库的构建步骤包括：(1)对白细胞样本进行dna片段化、末端修补、da加尾处理；(2)接头连接并纯化；(3)双端标记udi，然后进行pcr(聚合酶链式反应)扩增、纯化，得到预文库一；(4)预文库一的质控。
12、da加尾：指在dna分子的3'末端通过酶促反应加上一个由腺嘌呤(a)核苷酸组成的序列，形成腺嘌呤核苷酸尾(a tail)。
13、udi：unique dual index，是指双端唯一index序列的接头；index是一种标记序列，用于标识dna样本。
14、优选的，所述预文库一的质控中，预文库一的浓度≥50ng/μl，预文库二的平均长度为300bp-400bp。
15、优选的，所述s2步骤中，cfdna杂交文库的构建步骤包括：(1)cfdna定量；(2)cfdna的末端修补、da加尾；(3)末端umi接头连接并纯化；(4)pcr扩增、纯化，得到预文库二；(5)预文库二的质控。
16、优选的，所述预文库二的质控中，预文库二的浓度＞25ng/μl，预文库二的平均长度为250bp-350bp。
17、优选的，所述s3步骤中，杂交捕获的步骤包括：(1)将预文库一或预文库二与探针杂交；(2)制备捕获磁珠；(3)将捕获磁珠作用于(1)杂交体系，捕获目标区域dna文库；(4)捕获后进行pcr扩增，得到终文库；(5)终文库的质控；(6)终文库的上机测序。
18、优选的，所述杂交dna文库的质控中，预文库二的浓度为1-20ng/μl，杂交dna文库的主峰长度为270bp-320bp。
19、优选的，所述探针信息见下表1。
20、表1
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31、<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种无需获取淋巴瘤组织样本检测ctDNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的无需获取淋巴瘤组织样本检测ctDNA的方法，其特征在于，所述步骤一包括：采集血液样本，1000-4000rpm条件下离心5-15min，收集上层液体，即为血浆样本；收集下层细胞，去除红细胞，得到白细胞样本。
3.根据权利要求1所述的无需获取淋巴瘤组织样本检测ctDNA的方法，其特征在于，所述步骤二包括：S1.构建白细胞基因组DNA杂交文库；S2.构建cfDNA杂交文库；S3.杂交捕获；
4.根据权利要求3所述的无需获取淋巴瘤组织样本检测ctDNA的方法，其特征在于，所述S3步骤中，杂交捕获的步骤包括：(1)将预文库一或预文库二与探针杂交；(2)制备捕获磁珠；(3)将捕获磁珠作用于(1)杂交体系，捕获目标区域DNA文库；(4)捕获后进行PCR扩增，得到终文库；(5)终文库的质控；(6)终文库的上机测序。
5.根据权利要求1所述的无需获取淋巴瘤组织样本检测ctDNA的方法，其特征在于，所述步骤三包括：(1)对测序数据进行背景噪音和胚系
6.根据权利要求5所述的无需获取淋巴瘤组织样本检测ctDNA的方法，其特征在于，所述过滤包括对cfDNA的过滤，过滤原则设置为：
7.根据权利要求5所述的无需获取淋巴瘤组织样本检测ctDNA的方法，其特征在于，所述过滤还包括对胚系样本的过滤，过滤原则设置为：如果白细胞样本的测试结果中支持突变读长数大于1，且突变频率大于0.005，且该位点测序深度大于50，且该位点支持突变读长平均碱基质量>30，则需要在初发样本中排除这个位点；
8.根据权利要求5所述的无需获取淋巴瘤组织样本检测ctDNA的方法，其特征在于，所述cfDNA中的ctDNA当量计算包括(1)计算ctDNA占比；(2)计算ctDNA浓度；其中：
9.根据权利要求8所述的无需获取淋巴瘤组织样本检测ctDNA的方法，其特征在于，计算ctDNA浓度时：
10.一种根据权利要求1-9任一项所述的方法在淋巴瘤检测中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种无需获取淋巴瘤组织样本检测ctdna的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的无需获取淋巴瘤组织样本检测ctdna的方法，其特征在于，所述步骤一包括：采集血液样本，1000-4000rpm条件下离心5-15min，收集上层液体，即为血浆样本；收集下层细胞，去除红细胞，得到白细胞样本。
3.根据权利要求1所述的无需获取淋巴瘤组织样本检测ctdna的方法，其特征在于，所述步骤二包括：s1.构建白细胞基因组dna杂交文库；s2.构建cfdna杂交文库；s3.杂交捕获；
4.根据权利要求3所述的无需获取淋巴瘤组织样本检测ctdna的方法，其特征在于，所述s3步骤中，杂交捕获的步骤包括：(1)将预文库一或预文库二与探针杂交；(2)制备捕获磁珠；(3)将捕获磁珠作用于(1)杂交体系，捕获目标区域dna文库；(4)捕获后进行pcr扩增，得到终文库；(5)终文库的质控；(6)终文库的上机测序。
5.根据权利要求1所述的无需获取淋巴瘤组织样本检测ctdna的方法，其特征在于，所述步骤三包括：...
【专利技术属性】
技术研发人员：柯中和，赵维莅，王黎，王晨阳，俞浩，施晴，王鹏，张晓萌，顾林昊，辛贝贝，熊慧，
申请(专利权)人：上海源奇生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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