【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及冷冻电镜，尤其涉及冷冻电镜用亲和载网及其冷冻样品的制备方法和应用。
技术介绍
1、冷冻电子显微镜(cryo-em)自20世纪70年代出现以来，经过长期发展，尤其是基于近十几年来硬件和软件的技术革新，已成为当前最重要的解析生物大分子近原子分辨率结构的手段，这极大推进了从分子水平上阐明生物学机制的研究进程。首先，生物样品通过滴加到由支撑膜覆盖的载网上，然后经由液氮冷却的液态乙烷或丙烷速冻形成玻璃态的无定型冰层，从而使生物大分子在冷冻样品中保持近生理状态，而且一定厚度的玻璃态冰的包埋也减少了电子束对生物大分子的辐射损伤。最后利用透射电子显微镜对冷冻样品进行数据收集以及重构计算可获得生物大分子的三维结构。
2、随着电镜技术的发展，电子显微镜、探测器以及处理图片的算法都已不再是制约结构解析的难题，然而冷冻电镜技术仍然面临着一些瓶颈，严重限制了该技术解析生物分子结构的效率。其中一个重要瓶颈是冷冻样品的制备，这通常包括一系列繁琐的样品纯化过程和用于电镜观察的冷冻载网的制备过程。目前，冷冻样品制备存在的主要问题包括生物大分子及超大分子复合体样品难获得、制样过程中气–液界面对生物样品产生的损伤、生物样品分布的取向倾向性，以及冷冻电镜制样前期的生物样品纯化过程极为繁琐等问题。这些问题导致许多结构生物学研究需要在样品优化上投入大量的时间和精力。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种冷冻电镜用亲和载网及其冷冻样品的制备方法和应用。本专利技术提供的冷冻电镜用亲
2、第一方面，本专利技术提供的冷冻电镜用亲和载网，包括覆盖于载网上的碳质承载膜，与所述碳质承载膜连接的有机小分子pyr-nhs，以及与所述有机小分子pyr-nhs连接的特异性抗体蛋白；所述碳质承载膜为石墨烯膜、氧化石墨烯膜或碳膜。本专利技术中，利用具有共轭结构的有机小分子pyr-nhs通过π-π堆积相互作用与载网表面所覆盖的碳原子的杂化状态为sp2杂化的石墨烯、氧化石墨烯或碳膜紧密结合，对上述sp2杂化的特定碳质承载膜表面进行非共价键修饰，同时pyr-nhs的n-羟基琥珀酰亚胺酯活性基团与抗体蛋白赖氨酸侧链以及氨基端的伯胺发生交联反应，将抗体nz-1固定于载网表面，本专利技术获得的亲和载网能实现直接从细胞裂解液中亲和融合表达了pa标签的目的蛋白以进行冷冻制样并进行高分辨率冷冻电镜结构解析，简化了蛋白质纯化流程，易于操作，可应用于抗原–抗体等基于亲和作用的反应体系实现对不同蛋白的锚定。本专利技术所提供的亲和载网应用于冷冻电镜研究的冷冻制样，能够实现亲和载网直接从细胞裂解液中对目标蛋白的特异性富集，极大程度简化了冷冻样品制备前的蛋白质复合体的纯化过程。而且不用对碳质承载膜进行氧等离子体处理，也无需采用特殊成分的缓冲液处理载网。本专利技术提供的特定亲和载网能更好地将目的蛋白锚定在载网表面，尤其是克服了蛋白质纯化过程繁琐、气–液界面导致的蛋白质易碎、分布取向倾向性等问题，本专利技术在提高了冷冻制样的成功率的同时提高了所述亲和载网制备的冷冻样品的质量，并提高了样品制备的效率，通过常规的单颗粒分析流程可以重构得到复合体的高分辨率结构，应用所述亲和载网直接从细胞裂解液中亲和目的蛋白制备的冷冻样品背景干净，能更好地用于后续冷冻电镜数据收集以及高分辨率结构解析。
3、作为优选，所述特异性抗体蛋白为nz-1抗体蛋白。
4、进一步优选，所述亲和载网由包括以下步骤的方法制得：应用有机小分子pyr-nhs将nz-1抗体蛋白固定在覆盖于载网上的所述碳质承载膜的表面。
5、第二方面，本专利技术提供的一种冷冻电镜用亲和载网的制备方法，包括以下步骤：应用有机小分子pyr-nhs将特异性抗体蛋白固定在覆盖于载网上的碳质承载膜的表面，制得亲和载网；所述碳质承载膜为石墨烯膜、氧化石墨烯膜或碳膜；所述特异性抗体蛋白优选为nz-1抗体蛋白。
6、作为优选，所述的冷冻电镜用亲和载网的制备方法包括：
7、1)将覆盖有石墨烯膜、氧化石墨烯膜或碳膜的载网浸泡于pyr-nhs溶液中进行反应；
8、2)将步骤1)处理的载网进行清洗和干燥，得到表面附着有pyr-nhs的载网；
9、3)以步骤2)得到的载网表面的pyr-nhs为交联剂，将nz-1抗体溶液覆于所述载网表面并孵育，得到亲和载网。
10、进一步优选，步骤1)中，所述pyr-nhs溶液的浓度为0.8～1.2mm；所述浸泡的温度为10～30℃，浸泡时间为45min～2h；优选的，包括将pyr-nhs溶解于第一有机溶剂，得到所述pyr-nhs溶液；所述第一有机溶剂优选为dmf或甲醇。
11、进一步优选，步骤2)中，所述清洗的步骤包括：在所述载网上滴加第二有机溶剂，然后从所述载网侧边缘吸干表面液体，所述清洗的步骤重复3～5次；优选的，所述第二有机溶剂包括dmf或甲醇，每次滴加5～10μl；干燥温度优选为16～26℃，干燥时间为10～15min。
12、进一步优选，步骤3)中，包括将5～10μl终浓度为25～100μg/ml的nz-1抗体溶液滴加于所述载网表面并在4～25℃孵育45min～3h，得到将nz-1抗体蛋白固定于所述载网表面的亲和载网；优选的，所述nz-1抗体溶液的溶剂为不含有氨基的缓冲液，优选为pbs缓冲液、醋酸盐缓冲液或hepes缓冲液；所述孵育后优选还包括使用第二缓冲液对所述载网表面进行清洗的步骤；所述第二缓冲液为含有氨基的缓冲液，优选为tris缓冲液或甘氨酸溶液。
13、第三方面，本专利技术还提供所述的冷冻电镜用亲和载网或所述的冷冻电镜用亲和载网的制备方法得到的亲和载网在制备冷冻电镜的冷冻样品中的应用；优选的，将亲和载网应用于从细胞裂解液中直接特异性富集含pa标签的目标蛋白。
14、第四方面，本专利技术提供一种冷冻样品的制备方法，包括：应用有机小分子pyr-nhs将nz-1抗体蛋白固定在覆盖于载网上的碳质承载膜的表面，制备亲和载网；将所述亲和载网与含有目标蛋白的细胞裂解液进行孵育，使亲和载网从细胞裂解液中亲和所述目的蛋白，直接冷冻制样；所述细胞裂解液中的目的蛋白采用融合表达pa标签的目的蛋白，所述碳质承载膜为石墨烯膜、氧化石墨烯膜或碳膜。
15、作为优选，所述的冷冻样品的制备方法包括将细胞裂解液进行高速离心，超速离心和甘油密度梯度离心处理，得到含有融合表达pa标签的目标蛋白的细胞裂解粗处理液；将所述亲和载网固定于细胞培养板中，在所述细胞培养板中加入所述细胞裂解粗处理液进行孵育。
16、进一步优选，所述的冷冻样品的制备方法包括将所述细胞裂解液进行10000～50000g离心15～45min，然后1000本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种冷冻电镜用亲和载网，其特征在于，包括覆盖于载网上的碳质承载膜，与所述碳质承载膜连接的有机小分子pyr-NHS，以及与所述有机小分子pyr-NHS连接的特异性抗体蛋白；所述碳质承载膜为石墨烯膜、氧化石墨烯膜或碳膜。
2.根据权利要求1所述的冷冻电镜用亲和载网，其特征在于，所述特异性抗体蛋白为NZ-1抗体蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的冷冻电镜用亲和载网，其特征在于，所述亲和载网由包括以下步骤的方法制得：应用有机小分子pyr-NHS将NZ-1抗体蛋白固定在覆盖于载网上的所述碳质承载膜的表面。
4.一种冷冻电镜用亲和载网的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：应用有机小分子pyr-NHS将特异性抗体蛋白固定在覆盖于载网上的碳质承载膜的表面，制得亲和载网；所述碳质承载膜为石墨烯膜、氧化石墨烯膜或碳膜；所述特异性抗体蛋白优选为NZ-1抗体蛋白。
5.根据权利要求4所述的冷冻电镜用亲和载网的制备方法，其特征在于，包括：
6.权利要求1-3任一项所述的冷冻电镜用亲和载网或权利要求4或5所述的冷冻电镜用亲和载网的制备方法得到的
7.一种冷冻样品的制备方法，其特征在于，包括：应用有机小分子pyr-NHS将NZ-1抗体蛋白固定在覆盖于载网上的碳质承载膜的表面，制备亲和载网；将所述亲和载网与含有目标蛋白的细胞裂解液进行孵育，使亲和载网从细胞裂解液中亲和所述目的蛋白，直接冷冻制样；所述细胞裂解液中的目的蛋白采用融合表达PA标签的目的蛋白，所述碳质承载膜为石墨烯膜、氧化石墨烯膜或碳膜。
8.根据权利要求7所述的冷冻样品的制备方法，其特征在于，包括将细胞裂解液进行高速离心和甘油密度梯度离心处理，得到含有融合表达PA标签的目标蛋白的细胞裂解粗处理液；将所述亲和载网固定于细胞培养板中，在所述细胞培养板中加入所述细胞裂解粗处理液进行孵育后冷冻制样。
9.权利要求7-8任一项所述的冷冻样品的制备方法制得的冷冻样品在生物大分子结构解析中的应用，所述应用为以下任一：
...【技术特征摘要】
1.一种冷冻电镜用亲和载网，其特征在于，包括覆盖于载网上的碳质承载膜，与所述碳质承载膜连接的有机小分子pyr-nhs，以及与所述有机小分子pyr-nhs连接的特异性抗体蛋白；所述碳质承载膜为石墨烯膜、氧化石墨烯膜或碳膜。
2.根据权利要求1所述的冷冻电镜用亲和载网，其特征在于，所述特异性抗体蛋白为nz-1抗体蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的冷冻电镜用亲和载网，其特征在于，所述亲和载网由包括以下步骤的方法制得：应用有机小分子pyr-nhs将nz-1抗体蛋白固定在覆盖于载网上的所述碳质承载膜的表面。
4.一种冷冻电镜用亲和载网的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：应用有机小分子pyr-nhs将特异性抗体蛋白固定在覆盖于载网上的碳质承载膜的表面，制得亲和载网；所述碳质承载膜为石墨烯膜、氧化石墨烯膜或碳膜；所述特异性抗体蛋白优选为nz-1抗体蛋白。
5.根据权利要求4所述的冷冻电镜用亲和载网的制备方法，其特征在于，包括：
6.权利要求1-3任一项所述的冷冻电镜用亲和载网或...
【专利技术属性】
技术研发人员：丛尧，赵巧钰，洪晓喻，王艳兴，
申请(专利权)人：中国科学院分子细胞科学卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：
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