【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物抗病分子鉴定，具体涉及油菜根肿菌抗病性的早期高效鉴定方法及应用。
技术介绍
1、根肿病是由一种专性活体寄生的原生生物根肿菌(plasmodiophora brassicaeworon)引起的病害，对十字花科植物造成重大危害。感染根肿菌的植株根部会异常膨大，影响根组织对养分和水分的吸收。严重感染的植株可能表现出缺水症状，甚至导致植株枯死。田间试验结果显示，根肿病可导致油菜产量减少30％，在严重受害的情况下，产量损失可高达80％至90％。多年来，这种由土壤传播的疾病已经导致全球十字花科作物的产量和质量下降(dixon g r.the occurrence and economic impact of plasmodiophora brassicaeand clubroot disease.j plant growth regul.,2009,28:194-202.)。根肿菌的休眠孢子在适当条件下能在土壤中存活长达17年(hasan j.clubroot in brassica:recentadvances in genomics,breeding,and disease management[j].genome,2021,64(8):735-760.)。受到污染的土壤在此期间将不再适合种植十字花科作物。我国是全球最大的芸薹属作物种植国家(邱翠金.世界芸薹属作物生产与贸易分析[j].世界农业,2014(5):111-118,127.)。自1936年以来，根肿病在我国台湾省首次被报道，随后在我国各地蔓延。目前，根肿病至
2、国内外众多学者已对根肿菌的检测开展了大量研究，特别是在植物对根肿菌的抗性机制及其育种利用方面，这些研究均离不开抗病种质资源的筛选鉴定。抗病性的早期鉴定因其能有效降低人工和空间成本，在精准可控的环境条件下实现抗根肿病种质资源的高通量、大群体筛选的优势，对于对全面、深入开展根肿菌的研究，加快植物抗根肿病育种进程具有十分重要的意义。在油菜抗根肿病的研究中，传统方法主要依赖于根部表型分析。fedptova(1933年)最早通过显微镜观察到根肿菌的休眠孢子，此技术随后由melbile(1952年)和hawken(1967年)进一步改进，发展成植物诱导法。该方法通过将寄主植物种植于待测土壤中，经过30至40天观察寄主的病症表现。然而，这一方法耗时较长，且需要大量人力和培养空间，不利于实现根肿病抗性种质资源的高通量筛选。为缩短观察时间并提高鉴定效率，研究人员引入了荧光染色技术。通过使用亲脂性染料nile red对根肿菌进行染色，在荧光显微镜下可以清晰观察到其脂滴结构。此外，dapi是一种能够与dna强结合的荧光染料，研究人员将nile red与dapi联合使用，对抗感材料的皮层细胞进行染色。在荧光显微镜下，这种组合染色可以帮助区分被根肿菌侵染的材料与未侵染的材料，从而更早地判断寄主植物的抗感性。这项染色技术能够将抗病与感病材料的判定时间缩短至接菌后16天内完成，但该方法仍然需要较高的人工和空间成本，且显微镜观察对技术人员的经验要求较高，样品处理和观察过程也非常耗时。随着分子生物学技术的发展，研究人员在接菌后20天通过转录组分析筛选出了在感病材料中显著上调的基因，并通过qrt-pcr技术进一步验证，最终确定了4个标记基因。这些标记基因在感病材料中的表达水平显著高于抗病材料，能够作为判定材料抗病性和感病性的分子标记(刘燕,油菜根肿病早期检测体系的建立及根肿菌效应因子初步鉴定[d],华中农业大学,2017)。但该技术容易受到环境因素的影响，导致检测结果出现波动，此外，该技术仍存在时间长、空间成本高等问题，使得这一方法在实际应用中存在一定局限性。
3、鉴于植物对根肿菌抗性的早期鉴定手段存在上述缺陷，有必要构建高效稳定的根肿菌抗性早期鉴定方法。这对于深入推进根肿菌的基础研究，加快油菜抗根肿病育种进程，以及保障我国农业生产的安全与稳定具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术旨在克服现有技术的不足，通过提取油菜根部dna并采用荧光定量pcr技术，检测根肿菌在油菜根部的定殖能力，力求建立一套准确的根肿菌早期侵染鉴定方法。该方法将为根肿菌基础研究的深入开展以及抗病品种的培育提供便捷高效的检测手段。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、油菜根肿病抗性的早期鉴定方法，包括以下步骤：
4、(1)将待测油菜和已知抗根肿病油菜、感根肿病油菜的无菌苗种植后，在苗期油菜根部土壤接种根肿菌；
5、(2)在接种根肿菌后的第5天，提取待测油菜根部组织的dna并对根肿菌特异基因进行qpcr检测，以已知抗根肿病油菜作为对照组，内参基因源于油菜，计算所述基因的相对含量；
6、(3)根据所述基因的相对含量鉴定待测油菜对根肿病的抗感性；
7、具体地，如果待测油菜的根肿菌基因的相对含量小于已知抗根肿病油菜的1.5倍，则待测油菜鉴定为抗根肿病品种；如果待测油菜的根肿菌基因的相对含量大于已知感根肿病油菜的2/3，则待测油菜鉴定为感根肿病品种。
8、优选地，所述根肿菌特异基因为pbactin，内参基因为bnactin。
9、与现有技术相比，本专利技术具有以下优点及有益效果：
10、(1)首次以根肿菌dna作为检测目标，dna水平的检测相较于rna水平能够更早地发现病原体，从而满足早期鉴定的需求。
11、(2)以根肿菌dna作为检测目标比rna更为可靠，因为rna易受外界环境的影响，稳定性较差，而dna具有较高的稳定性，能够满足精确鉴定的要求。
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1.油菜根肿病抗性的早期鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，如果待测油菜的根肿菌基因的相对含量小于已知抗根肿病油菜的1.5倍，则待测油菜鉴定为抗根肿病品种；如果待测油菜的根肿菌基因的相对含量大于已知感根肿病油菜的2/3，则待测油菜鉴定为感根肿病品种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述根肿菌特异基因为PbActin，内参基因为BnActin。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PbActin的引物为5'-GGGACATCACCGACTACCTG-3'，5'-ACTGCTCCGAGTTGGACATC-3'。
【技术特征摘要】
1.油菜根肿病抗性的早期鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，如果待测油菜的根肿菌基因的相对含量小于已知抗根肿病油菜的1.5倍，则待测油菜鉴定为抗根肿病品种；如果待测油菜的根肿菌基因的相对含量大于已知感根肿病油菜的2/3，则待测油菜鉴定为感根肿病品种。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：王睿，倪子涵，安甜天，徐姊玥，易为宏，王茂林，赵云，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：
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