【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种产紫色杆菌素的基因工程菌的构建方法和应用。
技术介绍
1、紫色杆菌素(violacein)是某些特殊微生物代谢过程中产生一种天然吲哚衍生物，呈现出漂亮的蓝紫色，是一种纯粹的天然微生物色素。紫色杆菌素具有多种生物活性如抗肿瘤、抑菌、抗生素潜力、抗真菌、抗藻、抗癌和抗病毒等，其不仅可以单独发挥抑菌抗菌活性，还可以与其他抗生素协同发挥作用，使抑菌活性倍增，在生物医药领域具有极大的应用开发价值；而其独特的蓝紫色，在化妆品、纺织印染等行业也到广泛应用。
2、但是由于产紫色杆菌素原始菌株通常具有培养条件苛刻、生长缓慢、色素产量不稳定等缺点，使紫色杆菌素的大宗工业化生产受到限制，因此，通过基因工程或合成生物学手段，构建重组菌株提高紫色杆菌素产量的研究备受关注。
3、酵母表达系统可高水平表达蛋白，且具有翻译后修饰功能，是表达大规模蛋白的有力工具。在表达基因工程产物时，与其他微生物相比，酿酒酵母具有遗传背景清晰、遗传操作体系简单成熟、安全性高、易于大规模培养从而降低生产成本等优点，广泛用于外源蛋白的表达相关研究。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是提供一种可产紫色杆菌素的基因工程菌的构建方法及其生物法产紫色杆菌素的应用。
2、为解决上述技术问题，本专利技术提供一种产紫色杆菌素(violacein)的基因工程菌：在酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)中插入紫色杆菌素合成途径相关基因表达盒并过表达vi
3、即，所述产紫色杆菌素(violacein)的基因工程菌是s.cerevisiae及其同科同属的菌株中插入紫色杆菌素合成途径相关基因表达盒并过表达vioc基因所得。
4、说明：构建产紫色杆菌素合成基因簇的底盘微生物不仅限于酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)ysg50，凡是可以表达产紫色杆菌素合成基因簇的所有微生物均可使用。
5、作为本专利技术的产紫色杆菌素(violacein)的基因工程菌的改进：
6、紫色杆菌素合成途径相关基因表达盒为：
7、vioa基因表达盒(seq id no.2)、viob基因表达盒(seq id no.3)、vioc基因表达盒(seq id no.4)、viod基因表达盒(seq id no.5)、vioe基因表达盒(seq id no.6)。
8、作为本专利技术的产紫色杆菌素(violacein)的基因工程菌的进一步改进：
9、还包括ura基因表达盒(seq id no.1)和vioc过表达基因表达盒(seq id no.7)。
10、即，所述紫色杆菌素合成途径相关基因表达盒的核苷酸序列如seq id no.1-seqid no.7所述。也包括seq id no.1-seq id no.7的其同源和同功能基因。
11、作为本专利技术的产紫色杆菌素(violacein)的基因工程菌的进一步改进：
12、紫色杆菌素基因簇来源于duganella sp.中，但不仅限与该菌株，与本菌株中的相似序列可合成紫色杆菌素的基因簇的核苷酸序列。
13、说明：紫色杆菌素基因簇中含有vioa,viob,vioc，viod，vioe存在与duganella sp中，在此基础上构建基因表达盒。
14、本专利技术还同时提供了利用上述基因工程菌进行的紫色杆菌素的制备方法，包括以下步骤：
15、将基因工程菌s.cerevisiae ysg50-vio-vioc+接种至发酵培养基进行发酵培养，收集发酵液，所述发酵液中含有紫色杆菌素。
16、作为本专利技术的紫色杆菌素的制备方法的改进：将发酵液进行分离纯化，获得紫色杆菌素。
17、作为本专利技术的紫色杆菌素的制备方法的进一步改进：发酵培养基中接种量为0.5％～2.5％(体积％)，发酵培养温度为30～40℃，发酵培养时间为12～48h。
18、作为本专利技术的紫色杆菌素的制备方法的进一步改进：发酵培养基中含有浓度为10g/l～30g/l的葡萄糖。
19、即，发酵培养基以葡萄糖为底物发酵产生紫色杆菌素。
20、作为本专利技术的紫色杆菌素的制备方法的进一步改进：分离纯化方法利用旋转蒸发仪乙醇复溶法，而后通过冷冻干燥法制备获得紫色杆菌素。
21、本专利技术所述的基因工程菌构建方法是以酿酒酵母为出发菌株，利用酿酒酵母染色体多拷贝位合整合方式敲入紫色杆菌合成途径相关表达盒，具体敲入过程详见实施例1。
22、本专利技术的方法获得的基因工程菌以以葡萄糖为底物，接种量0.5％～2.5％，外源色氨酸的添加量为0g/l～1.6g/l，在30℃～40℃下培养12～60h的条件下发酵可产紫色杆菌素。
23、本专利技术构建的基因工程菌，发酵获得的代谢物，利用旋转蒸发仪以及冷冻干燥机，获得紫色杆菌素粗提物(如图12)，具体过程详见实施例2。
24、本专利技术获得的基因工程菌产物，进一步进行紫色杆菌素组成分析，通过uplc-q/tof-ms定性，采用masslynx v4.2对正、负离子模式总离子流图进行处理，结合mass值、保留时间和分子式匹配软件，用unifiportal软件进行数据分析，定性检测紫色杆菌素，具体过程详见实施例3。
25、本专利技术获得的基因工程菌在以葡萄糖为底物，接种量0.5％～2.5％，在30℃～40℃下培养12～60h的条件下发酵可产紫色杆菌素0.1～145.28mg/l，即，每l发酵液能制备获得0.1～145.28mg紫色杆菌素。
26、本专利技术的有益效果主要体现在：目前，通过生物发酵产紫色杆菌素的菌株主要集中在紫色杆菌和紫色杜氏杆菌，而利用酿酒酵母生产紫色杆菌素的研究方法在近年来的报道中很少。除此之外，通过利用δ和rdna多拷贝位点整合紫色杆菌素合成代谢途径相关基因表达盒生产紫色杆菌素的方法尚未见报道。δ和rdna多拷贝位点整合是效率极高的染色体整合方式且酿酒酵母是最广泛的真核模式生物。本专利技术的方法为生产者提供了通过生物合成法生产甘露糖的新路径以及拓宽了研究者对生物合成紫色杆菌素研究的新思路
27、综上，本专利技术公开了一种通过插入紫色杆菌素合成途径相关基因表达盒，酿酒酵母产紫色杆菌素(violacein)的方法及其应用。专利技术所述的出发菌株为酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，产紫色杆菌素的基因工程菌是在酿酒酵母(s.cerevisiae)中插入紫色杆菌素合成途径相关基因表达盒，其中所述的基因紫色杆菌素合成途径相关基因表达盒如序列表中seq id no.1-seq id no.7所示。本专利技术提供的产紫色杆菌素基因工程菌的构建方法获得基因工程菌，可利用含葡萄糖(glucose)为底物，在发酵过程中可产生紫色杆菌素。
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1.产紫色杆菌素(Violacein)的基因工程菌，其特征在于：在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中插入紫色杆菌素合成途径相关基因表达盒并过表达vioC基因后，得到产紫色杆菌素(Violacein)的基因工程菌S.cerevisiae YSG50-vio-vioC+。
2.根据权利要求1所述的产紫色杆菌素(Violacein)的基因工程菌，其特征在于：
3.根据权利要求2所述的产紫色杆菌素(Violacein)的基因工程菌，其特征在于：
4.根据权利要求1～3任一所述的产紫色杆菌素(Violacein)的基因工程菌，其特征在于：
5.利用如权利要求1～4任一所述的基因工程菌进行的紫色杆菌素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的紫色杆菌素的制备方法，其特征在于：将发酵液进行分离纯化，获得紫色杆菌素。
7.根据权利要求5或6所述的紫色杆菌素的制备方法，其特征在于：
8.根据权利要求7所述的紫色杆菌素的制备方法，其特征在于：
9.根据权利要求
...【技术特征摘要】
1.产紫色杆菌素(violacein)的基因工程菌，其特征在于：在酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)中插入紫色杆菌素合成途径相关基因表达盒并过表达vioc基因后，得到产紫色杆菌素(violacein)的基因工程菌s.cerevisiae ysg50-vio-vioc+。
2.根据权利要求1所述的产紫色杆菌素(violacein)的基因工程菌，其特征在于：
3.根据权利要求2所述的产紫色杆菌素(violacein)的基因工程菌，其特征在于：
4.根据权利要求1～3任一所述的产紫色杆菌素(vio...
【专利技术属性】
技术研发人员：董益恒，陈佳乐，赵洪新，翟梗然，付红伟，曾国红，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：
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