【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种从枳椇子中提取分离2,5-dof和2,6-dof单体，以及采用spe-hplc-uv法同时测定枳椇子中这两种化合物含量的方法，属于天然药物化学研究领域。
技术介绍
1、枳椇子为鼠李科(rhamnaceae)枳椇属(hovenia thunb)植物枳椇(hoveniaacerba lindl.)的干燥成熟种子，有木蜜、鸡脚爪、拐枣、酸枣等别称。主要分布于中国、印度、朝鲜、日本。在我国主产于陕西秦巴山区，四川、湖北、浙江、江苏、安徽、福建等地也有分布。目前全球共发现3种枳椇属植物和两个变种，分别为枳椇(hovenia acerba lindl.)、北枳椇(hovenia dulcis thunnb.)、毛果枳椇(hovenia trichocarpa chun et tsiang.)以及光叶毛果枳椇(hovenia trichocarpa var.robusta)和俅江枳椇(hovenia acerba varkiukiangensis)两个变种。
2、枳椇子为药食同源中药。其性平味甘，具有止渴除烦、解酒毒、镇惊、利尿之功效，多用于缓解醉酒、烦热、口渴、二便不利等症。现代药理研究表明枳椇子具有解酒保肝、抗氧化、抗肿瘤、降尿酸等作用。
3、枳椇属植物的化学成分包括黄酮类、萜类、脂肪酸类、木脂素类、生物碱类及其他成分，其中黄酮类、萜类为枳椇属植物的主要化学成分。
4、2,5-脱氧果糖嗪(2,5-dof)和2,6-脱氧果糖嗪(2,6-dof)单体是美拉德反应的中间产物,是一类重要的香味
5、至今为止尚没有从枳椇子中分得2,5-dof和2,6-dof及其含量测定的文献报道。
技术实现思路
1、本专利技术首次从枳椇子中提取分离了2,5-dof和2,6-dof单体，并在此基础上进一步专利技术了一种新的利用spe-hplc-uv法同时测定枳椇子中2,5-dof和2,6-dof含量的方法。
2、本专利技术的具体技术方案及研究结果如下：
3、1、枳椇子中2,5-dof和2,6-dof的提取、分离及结构鉴定
4、取枳椇子10kg，粉碎，加水回流提取3次，每次加水量均为100l，过滤，合并滤液，过d101型大孔吸附树脂吸附，先用0.2％的氢氧化钠水溶液洗脱，用水洗脱至流出液接近中性后再用85％的乙醇溶液洗脱，乙醇洗脱液减压回收溶剂得提取物，提取物分别以体积比为60：2：1的乙酸乙酯-乙醇-水的混合溶液进行第一次硅胶柱层析；取含有2,5-dof和2,6-dof的组分再以体积比为5：4：0.4的乙酸乙酯-乙醇-水的混合溶液为流动相进行第二次硅胶柱层析；取含有2,5-dof和2,6-dof的组分再以体积比为76：8：1的二氯甲烷-甲醇-水的混合溶液进行第三次硅胶柱层析；取含有2,5-dof和2,6-dof的组分再以体积比为15：3：0.4的二氯甲烷-甲醇-水的混合溶液为流动相进行第四次硅胶柱层析；取含有2,5-dof和2,6-dof的组分，最后采用氨基色谱柱以乙腈-水(89:11，v/v)为流动相，经制备型高效液相色谱分离纯化得到2,5-dof单体化合物64.2mg和2,6-dof单体化合物40.7mg。得到的单体化合物经hplc-uv检测(hplc色谱条件：色谱仪：华谱s6000；色谱柱：unitary nh2(5μm,100a,4.6×250mm)；流动相：乙睛-水(89：11，v/v),流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：20μl)，其纯度分别为95.4％、93.3％。通过将分得的单体化合物的核磁数据分别与文献报道的2,5-dof和2,6-dof核磁数据进行对比，最终确定其分别为2,5-dof和2,6-dof。
5、表1 2,5-dof的13cnmr(150mhz)核磁数据(δ，ppm，dmso)
6、
7、表2 2,6-dof的13c nmr(150mhz)核磁数据(δ，ppm，dmso)
8、
9、2、枳椇子中2,5-dof和2,6-dof的含量测定方法
10、2.1色谱条件
11、色谱柱为unitary nh2(5μm,100a,4.6×250mm)氨基柱，流动相为乙腈-水(89：11，v/v),流速1.0ml/min；柱温30℃；检测波长：275nm。(在此条件下，标准品和样品hplc色谱图见附图7、附图8)
12、2.2混合标准品储备溶液的制备
13、分别精密称取2,5-dof(纯度为95.4％)和2,6-dof(纯度为93.3％)的标准品，质量分别为10.1mg和10.2mg，加入少量75％甲醇溶液超声至全部溶解，将溶液转移至10ml容量瓶中，用75％甲醇溶液定容后摇匀，得到2,5-dof、2,6-dof浓度分别为0.964mg.ml-1和0.952mg.ml-1的混合标准品储备溶液。
14、2.3样品溶液的制备
15、取枳椇子粉末5g，回流提取3次，提取溶剂为纯水，提取时间依次为2h、1h、1h，纯水用量均为50ml，将3次提取液合并后过滤，通过装有30glk1300s型大孔吸附树脂柱吸附，0.2％naoh溶液淋洗，用水冲洗至中性，60％乙醇解吸，收集洗脱液，减压浓缩至干，用适量75％甲醇溶液超声溶解后定容至2ml容量瓶中，摇匀，得样品溶液，备用。
16、2.4方法学考察
17、2.4.1线性关系
18、从“2.2”制备的混合标准品储备溶液中精密移取5.00ml，2.00ml，1.00ml，0.50ml，0.20ml，0.1ml至10.0ml容量瓶中，分别用75％甲醇溶液稀释并定容，摇匀得到一系列浓度的混合标准溶液，其中2,5-dof和2,6-dof的浓度分别为：2,5-dof：0.964、0.482、0.193、0.096、0.048、0.019、0.001mg.ml-1；2,6-dof的浓度分别为：0.952、0.476、0.190、0.095、0.048、0.019、0.001mg.ml-1，进样前过0.22μm微孔滤膜，再分别用微量进样针精确移取20μl各浓度的标准溶液的续滤液，注入hplc色谱仪中，每个样品平行进样两次，记录2,5-dof和2,6-dof的色谱峰面积，取其平均值。以进样质量(m)为横坐标，峰面积(s)为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，数据见表3本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种2,5-脱氧果糖嗪(2,5-DOF)和2,6-脱氧果糖嗪(2,6-DOF)的制备方法，其特征在于用于制备2,5-DOF和2,6-DOF的原料为枳椇子。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于用水或有机溶剂的水溶液进行提取，水提取液直接过大孔吸附树脂吸附，有机溶剂提取液减压回收溶剂用水稀释后再过大孔吸附树脂吸附，吸附完毕后先用碱水洗脱，再用醇溶液洗脱，醇洗脱液减压回收溶剂得提取物，提取物利用正相柱层析进行分离。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述大孔吸附树脂为HP-20或D101或LK1300S型大孔吸附树脂中的一种或它们中的两种或两种以上的混合树脂，醇溶液为乙醇或甲醇溶液，所述正相柱层析固定相为硅胶或键合氨基的全多孔球形超纯硅胶。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于硅胶柱层析流动相为体积比为60:2:1～5:4:0.4的乙酸乙酯-乙醇-水的混合溶液或体积比为76：8：1～15：3：0.4的二氯甲烷-甲醇-水的混合溶液。
5.根据权利要求2所述方法，其特征在于以键合氨基的全多孔球形超纯硅胶进行分离
6.一种枳椇子中2,5-DOF和2,6-DOF的固相萃取-高效液相色谱-紫外检测器(SPE-HPLC-UV)含量测定方法，其特征在于所述SPE固定相为LK1300S型大孔吸附树脂，色谱柱为氨基色谱柱，流动相为乙腈-水混合溶液。
7.根据权利要求6所述的含量测定方法，其特征在于所用流动相为乙腈-水(89：11，V/V)，流速为1.0mL/min，柱温为30℃。
8.根据权利要求6所述的含量测定方法，其特征在于供试品溶液的制备方法为：取枳椇子粉末5g，纯水回流提取3次，提取时间依次为2h、1h、1h，纯水用量均为50mL，将3次提取液合并后过滤，滤液过LK1300S型大孔吸附树脂柱吸附，0.2％NaOH溶液淋洗，去除黄酮与其他色素杂质，60％乙醇解吸，收集洗脱液，减压浓缩至干，75％甲醇溶解后定容至2mL容量瓶中，摇匀即得。
...【技术特征摘要】
1.一种2,5-脱氧果糖嗪(2,5-dof)和2,6-脱氧果糖嗪(2,6-dof)的制备方法，其特征在于用于制备2,5-dof和2,6-dof的原料为枳椇子。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于用水或有机溶剂的水溶液进行提取，水提取液直接过大孔吸附树脂吸附，有机溶剂提取液减压回收溶剂用水稀释后再过大孔吸附树脂吸附，吸附完毕后先用碱水洗脱，再用醇溶液洗脱，醇洗脱液减压回收溶剂得提取物，提取物利用正相柱层析进行分离。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述大孔吸附树脂为hp-20或d101或lk1300s型大孔吸附树脂中的一种或它们中的两种或两种以上的混合树脂，醇溶液为乙醇或甲醇溶液，所述正相柱层析固定相为硅胶或键合氨基的全多孔球形超纯硅胶。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于硅胶柱层析流动相为体积比为60:2:1～5:4:0.4的乙酸乙酯-乙醇-水的混合溶液或体积比为76：8：1～15：3：0.4的二氯甲烷-甲醇-水的混合溶液。
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