【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种多重刺激响应性仿生纳米制剂及其制备方法。
技术介绍
1、传统药物缺乏靶向性，在杀伤肿瘤细胞的同时会损害机体正常细胞，产生不容忽视的毒副作用。脂质体作为抗肿瘤药物载体虽有诸多优点且部分已应用于临床，然而仍存在诸多问题。例如，靶向脂质体在肿瘤部位浓集却未提升抗肿瘤效果，存在药效与靶向性不匹配现象，如顺铂长循环脂质体在肿瘤中药时曲线下面积提高但抗肿瘤效果不佳，多柔比星长循环脂质体主要降低毒副作用，抗肿瘤效果与游离药物无显著差异，且长循环脂质体释药缓慢不利于药效发挥。
2、此外，聚乙二醇(peg)广泛用于热敏脂质体等纳米材料的修饰，peg化脂质体虽被认为几乎无免疫原性且临床研究和开发应用多年，但随着其在其他领域的广泛应用，发现部分健康人体内存在peg抗体，且重复注射peg化脂质体时会出现“加速血液清除”(abc)现象，这一免疫反应使peg化制剂的发展和临床应用面临挑战。同时，部分靶向定位于细胞内的刺激响应性纳米递送系统存在药物在肿瘤细胞外释放的问题，扩散到血液中的药物会给邻近正常组织带来毒性甚至引起多重耐药，因此开发细胞内药物精准释放系统在肿瘤治疗中至关重要。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种多重刺激响应性仿生纳米制剂及其制备方法，以解决现有抗肿瘤药物脂质体存在的药效与靶向性不匹配、peg化脂质体的abc现象以及细胞外药物释放导致的毒性等问题，并且利用原儿茶醛对仿生热敏脂质体的稳定作用提升纳米制剂的性能。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：
3、本专利技术提供的一种多重刺激响应性仿生纳米制剂，其为具有多重刺激响应性的仿生纳米核壳体系，包括内核和外壳，内核为载药的金纳米笼(auncs)，金纳米笼表面通过谷胱甘肽敏感的金硫键(au-s)连接β-环糊精(β-cd)以封堵药物，金刚烷胺-原儿茶醛形成的亚胺(ada-pca)通过环糊精-金刚烷间的主客体相互作用镶嵌在纳米颗粒表面，外壳为杂合膜仿生热敏脂质体(hmbtl)，其包含血小板膜(pm)、红细胞膜(em)和热敏脂质体(tsl)。
4、本专利技术还提供了一种上述多重刺激响应性仿生纳米制剂的制备方法，该方法包括以下步骤：
5、①金纳米笼(auncs)的制备：在烧瓶中加入硝酸银、pvp和硫氢化钠溶液，搅拌反应，得到银纳米立方体；然后将银纳米立方体分散液加入到含haucl的水溶液中，搅拌反应，得到金纳米笼，通过控制haucl4的量使金纳米笼的lspr波长为750-800nm；
6、②金纳米笼的氨基化修饰：取金纳米笼的水分散液，加入巯基乙胺，搅拌、离心、干燥；
7、③金纳米笼的载药及封装：将氨基化金纳米笼与dox溶液混合搅拌、离心，取沉淀与羧甲基β-环糊精反应，洗涤后测定dox载药量包封率；
8、④金刚烷胺-原儿茶醛的亚胺结构(ada-pca)的合成：称取ada和pca，在dmso中反应、处理得到ada-pca；
9、⑤具有酸性ph、谷胱甘肽(gsh)还原性环境响应的载药金纳米笼内核(dox/auncs-β-cd/ada-pca)的构建：将装载有dox的auncs-β-cd分散于pbs中，然后加入制备好的金刚烷胺-原儿茶醛的亚胺结构(ada-pca)，并在室温下搅拌、离心、洗涤得到dox/auncs-β-cd/ada-pca；
10、⑥血小板膜(pm)的制备：从新鲜小鼠血液中提取血小板膜；
11、⑦红细胞膜(em)的制备：从新鲜小鼠血液中提取红细胞膜；
12、⑧血小板-红细胞杂合膜的制备：将上述血小板膜与红细胞膜在磷酸盐缓冲溶液中混匀，得到复合膜溶液，在脂质体挤压器上通过聚碳酸酯膜往复挤压，即得到血小板-红细胞杂合膜溶液；
13、⑨杂合膜仿生热敏脂质体(hmbtl)的制备：将血小板-红细胞杂合膜、dppc和mspc混合制备hmbtl；
14、⑩ph及gsh响应性载药金纳米笼内核(dox/auncs-β-cd/ada-pca)与杂合膜仿生热敏脂质体外壳(hmbtl)的组装：将hmbtl破膜后与金纳米笼超声组装。
15、进一步，步骤②金纳米笼的氨基化修饰的具体步骤为：向金纳米笼水分散液中加入巯基乙胺后，于室温在氮气保护下搅拌，离心并弃去上清，真空干燥保存备用。
16、进一步，步骤③金纳米笼的载药及封装的具体步骤为：通过扩散方式将盐酸阿霉素(dox)装载于氨基化的金纳米笼：将氨基化的金纳米笼悬浮于dox溶液中搅拌，离心收集上清和沉淀，沉淀为负载有dox的氨基化金纳米笼，然后将其加入edc/nhs活化的过量羧甲基β-环糊精并持续搅拌，收集产物并用超纯水洗涤，最后用荧光分光光度计测定所有上清中dox的含量，并计算颗粒中dox的载药量包封率。
17、进一步，步骤④金刚烷胺-原儿茶醛的亚胺结构(ada-pca)合成的具体步骤为：称取金刚烷甲胺(ada)和原儿茶醛(pca)，分别溶解于dmso中；随后将两种溶液混合，于50℃条件下搅拌4h；用旋转蒸发仪浓缩该溶液后，用乙醚和甲醇洗涤即得到终产物，记为ada-pca。
18、进一步，步骤⑥血小板膜(pm)制备的具体步骤为：首先，采集小鼠新鲜血液，将其小心置于预先经edta处理的ep管内，随即置于低温环境中，进行离心操作，持续20分钟，分离得到富含血小板的血浆；接着，将含血小板的血浆和含有edta、前列腺素e1以及蛋白酶抑制剂的pbs充分混合，再次在4℃条件下，以3400rpm的转速实施离心20分钟，以便进一步收集血小板沉淀；之后，把获得的血小板edta悬液转移至-80℃冰箱内进行深度冷冻处理，然后再放置于室温环境下使其自然解冻，如此反复进行多次冻融循环操作；完成冻融后，于4℃的低温环境下，以8000rpm的转速实施离心操作，时长为5分钟，收集沉淀产物，接着使用含有蛋白酶抑制剂的pbs溶液对沉淀进行多次仔细洗涤，最终成功获得纯净的血小板膜。
19、进一步，步骤⑦红细胞膜(em)制备的具体步骤：首先，采集小鼠新鲜血液，将其放入经edta(乙二胺四乙酸)处理过的离心管中，接着在低温条件下进行离心操作，分离出上清液并予以保留，对沉淀部分进行洗涤处理；随后，把血细胞转移至新的容器，加入磷酸盐缓冲溶液，放置于冰水浴中使红细胞充分裂解；之后，利用高速离心的方式除去血红蛋白，对得到的沉淀进行多次洗涤并再次离心，最终得到纯净的红细胞膜；将红细胞膜用磷酸盐缓冲溶液分散后，存放于4℃的冰箱中备用。
20、进一步，步骤⑨杂合膜仿生热敏脂质体(hmbtl)制备的具体步骤：把血小板-红细胞杂合膜、dppc(二棕榈酰磷脂酰胆碱)以及mspc(1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基卵磷脂)添加到含有蛋白酶抑制剂且ph值为7.4的pbs中混合均匀，在37℃的条件下孵育20分钟；接着，于37℃、100w功率下进行1分钟的超声处理，之后再在37℃下持续孵育30分钟；最后，利用脂质体挤出仪中孔本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多重刺激响应性仿生纳米制剂，其特征在于，其为具有多重刺激响应性的仿生纳米核壳体系，包括内核和外壳，内核为载药的金纳米笼(AuNCs)，金纳米笼表面通过谷胱甘肽敏感的金硫键(Au-S)连接β-环糊精(β-CD)以封堵药物，金刚烷胺-原儿茶醛形成的亚胺(Ada-PCA)通过环糊精-金刚烷间的主客体相互作用镶嵌在纳米颗粒表面，外壳为杂合膜仿生热敏脂质体(HMBTL)，其包含血小板膜(PM)、红细胞膜(EM)和热敏脂质体(TSL)。
2.根据权利要求1所述的一种多重刺激响应性仿生纳米制剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的一种多重刺激响应性仿生纳米制剂的制备方法，其特征在于，步骤②金纳米笼的氨基化修饰的具体步骤为：向金纳米笼水分散液中加入巯基乙胺后，于室温在氮气保护下搅拌，离心并弃去上清，真空干燥保存备用。
4.根据权利要求1所述的一种多重刺激响应性仿生纳米制剂的制备方法，其特征在于，步骤③金纳米笼的载药及封装的具体步骤为：通过扩散方式将盐酸阿霉素(DOX)装载于氨基化的金纳米笼；将氨基化的金纳米笼悬浮于DOX
5.根据权利要求1所述的一种多重刺激响应性仿生纳米制剂的制备方法，其特征在于，步骤④金刚烷胺-原儿茶醛的亚胺结构(Ada-PCA)合成的具体步骤为：称取金刚烷甲胺(Ada)和原儿茶醛(PCA)，分别溶解于DMSO中；随后将两种溶液混合，于50℃条件下搅拌4h；用旋转蒸发仪浓缩该溶液后，用乙醚和甲醇洗涤即得到终产物，记为Ada-PCA。
6.根据权利要求1所述的一种多重刺激响应性仿生纳米制剂的制备方法，其特征在于，步骤⑥血小板膜(PM)制备的具体步骤为：首先，采集小鼠新鲜血液，将其小心置于预先经EDTA处理的EP管内，随即置于低温环境中，进行离心操作，持续20分钟，分离得到富含血小板的血浆；接着，将含血小板的血浆和含有EDTA、前列腺素E1以及蛋白酶抑制剂的PBS充分混合，再次在4℃条件下，以3400rpm的转速实施离心20分钟，以便进一步收集血小板沉淀；之后，把获得的血小板EDTA悬液转移至-80℃冰箱内进行深度冷冻处理，然后再放置于室温环境下使其自然解冻，如此反复进行多次冻融循环操作；完成冻融后，于4℃的低温环境下，以8000rpm的转速实施离心操作，时长为5分钟，收集沉淀产物，接着使用含有蛋白酶抑制剂的PBS溶液对沉淀进行多次仔细洗涤，最终成功获得纯净的血小板膜。
7.根据权利要求1所述的一种多重刺激响应性仿生纳米制剂的制备方法，其特征在于，步骤⑦红细胞膜(EM)制备的具体步骤：首先，采集小鼠新鲜血液，将其放入经EDTA(乙二胺四乙酸)处理过的离心管中，接着在低温条件下进行离心操作，分离出上清液并予以保留，对沉淀部分进行洗涤处理；随后，把血细胞转移至新的容器，加入磷酸盐缓冲溶液，放置于冰水浴中使红细胞充分裂解；之后，利用高速离心的方式除去血红蛋白，对得到的沉淀进行多次洗涤并再次离心，最终得到纯净的红细胞膜；将红细胞膜用磷酸盐缓冲溶液分散后，存放于4℃的冰箱中备用。
8.根据权利要求1所述的一种多重刺激响应性仿生纳米制剂的制备方法，其特征在于，步骤⑨杂合膜仿生热敏脂质体(HMBTL)制备的具体步骤：把血小板-红细胞杂合膜、DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)以及MSPC(1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基卵磷脂)添加到含有蛋白酶抑制剂且pH值为7.4的PBS中混合均匀，在37℃的条件下孵育20分钟；接着，于37℃、100W功率下进行1分钟的超声处理，之后再在37℃下持续孵育30分钟；最后，利用脂质体挤出仪中孔径为100nm的聚碳酸酯膜反复挤压，即可得到均匀的杂合膜仿生热敏脂质体(HMBTL)。
9.根据权利要求1所述的一种多重刺激响应性仿生纳米制剂的制备方法，其特征在于，步骤⑩pH及GSH响应性载药金纳米笼内核(DOX/AuNCs-β-CD/Ada-PCA)与杂合膜仿生热敏脂质体外壳(HMBTL)组装的具体步骤：将步骤⑨筛选的具有合适相变温度的杂合膜仿生热敏脂质体反复冻融破膜，加入pH及GSH响应性载药金纳米笼内核，置入小玻璃瓶中，在18℃、53kHz的条件下，以100W功率超声2分钟，组装成具有核壳结构的杂合膜仿生纳米药物DOX/AuNCs-β-CD/Ada-PCA/HMBTL。
...【技术特征摘要】
1.一种多重刺激响应性仿生纳米制剂，其特征在于，其为具有多重刺激响应性的仿生纳米核壳体系，包括内核和外壳，内核为载药的金纳米笼(auncs)，金纳米笼表面通过谷胱甘肽敏感的金硫键(au-s)连接β-环糊精(β-cd)以封堵药物，金刚烷胺-原儿茶醛形成的亚胺(ada-pca)通过环糊精-金刚烷间的主客体相互作用镶嵌在纳米颗粒表面，外壳为杂合膜仿生热敏脂质体(hmbtl)，其包含血小板膜(pm)、红细胞膜(em)和热敏脂质体(tsl)。
2.根据权利要求1所述的一种多重刺激响应性仿生纳米制剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的一种多重刺激响应性仿生纳米制剂的制备方法，其特征在于，步骤②金纳米笼的氨基化修饰的具体步骤为：向金纳米笼水分散液中加入巯基乙胺后，于室温在氮气保护下搅拌，离心并弃去上清，真空干燥保存备用。
4.根据权利要求1所述的一种多重刺激响应性仿生纳米制剂的制备方法，其特征在于，步骤③金纳米笼的载药及封装的具体步骤为：通过扩散方式将盐酸阿霉素(dox)装载于氨基化的金纳米笼；将氨基化的金纳米笼悬浮于dox溶液中搅拌，离心收集上清和沉淀，沉淀为负载有dox的氨基化金纳米笼，然后将其加入edc/nhs活化的过量羧甲基β-环糊精并持续搅拌，收集产物并用超纯水洗涤，最后用荧光分光光度计测定所有上清中dox的含量，并计算颗粒中dox的载药量包封率。
5.根据权利要求1所述的一种多重刺激响应性仿生纳米制剂的制备方法，其特征在于，步骤④金刚烷胺-原儿茶醛的亚胺结构(ada-pca)合成的具体步骤为：称取金刚烷甲胺(ada)和原儿茶醛(pca)，分别溶解于dmso中；随后将两种溶液混合，于50℃条件下搅拌4h；用旋转蒸发仪浓缩该溶液后，用乙醚和甲醇洗涤即得到终产物，记为ada-pca。
6.根据权利要求1所述的一种多重刺激响应性仿生纳米制剂的制备方法，其特征在于，步骤⑥血小板膜(pm)制备的具体步骤为：首先，采集小鼠新鲜血液，将其小心置于预先经edta处理的ep管内，随即置于低温环境中，进行离心操作，持续20分钟，分离得到富含血小板的血浆；接着，将含血小板的血浆和含有edta、前列腺素e1以及蛋白酶抑制剂的pbs充分混合，再次在4℃条件下，...
【专利技术属性】
技术研发人员：李春明，陈万一，李丽仙，胡小刚，汪潇潇，胡玉荣，黄胜楠，余清华，刘宇，张娇，
申请(专利权)人：重庆大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：
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