【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学检测领域，具体的，本专利技术涉及一种选择性输血相关多种血细胞抗原的一体式基因分型方法及其应用。
技术介绍
1、人类红细胞表面血型抗原有362个，聚集在45个血型系统。人类血小板表面具有：abo和rh血型系统抗原、血小板特异性抗原(human plateletantigen，hpa)、白细胞抗原(human leukocyte antigen，hla)和cd36抗原等。而hpa有35种、hla-a、-b和-c蛋白有19252种蛋白、hla-drb1和-dqb1蛋白有3917种。血浆中也有hla表达。临床输血中常规红细胞输注仅对红细胞abo和rhd血型抗原进行交叉配型；常规血小板和血浆输注采用abo和rhd同型输注，而对血小板表面的hla、hpa和cd36等抗原不进行匹配。在常规输血配型策略下，输入非自身抗原的机率较高。研究表明，基于dna测序能够检测的血型抗原更广泛更精确，血型基因匹配的输血策略可以提高输血的有效性和安全性，尤其对需要反复用血、疑难配型、有输血或妊娠史、器官移植和输注无效等患者具有重要意义。
2、然而在目前的临床输血中，常规红细胞、血小板和血浆输注仅关注红细胞abo和rhd血型抗原进行配型，对hpa、hla和cd36等均不进行配型。血清学方法虽然简单易行且便宜，但无法避免异体抗原的输入和致敏。而对于那些已经有致敏史(输血史、妊娠史、器官移植等)、需要反复输血、血小板输注无效、自身免疫性疾病、癌症等患者，这种常规配血策略会带来非常严重的输血并发症，不仅不利于原发病的治疗，而且可能危及生命
3、在现有技术中，cn113215237a公开了一种hpa和hla抗原系统的同步检测试剂盒和方法，该方案采用探针捕获的方法对hpa和hla-a、-b、-c进行分型检测。为了尽量覆盖检测区域，该方案设计了大量探针，并从中不断优化，最终选择了多达498条探针，且该方案需要对每例样本提取的gdna进行机械打断和再捕获，操作流程复杂，操作成本贵，不适合大量样本的分型检测，并且该专利只检测了hpa和hla-i类基因。而cn114410758a公开了一种高效高特异性检测hpa基因型的方法和试剂盒，该方案采用等位基因特异性pcr方法对hpa基因型进行检测，每个样本需要用多组引物进行多反应管扩增，操作复杂，且仅对hpa的1～6、15、21等多态性位点进行分型检测。cn111218514a中公开了一种基于二代测序技术的abo基因全长序列测定方法和试剂包，该方案采用转座酶的方法对扩增的abo基因进行建库和ngs测序，操作流程复杂，且转座酶打断具有一定的偏好性，此专利仅对abo基因进行分型检测。综上，目前尚无涵盖血型抗原全面、操作简单、准确率高的基因分型检测方法。
技术实现思路
1、为了克服常规输血配型的局限性和现有技术的不足，本申请提供一种针对选择性输血相关的红细胞抗原、血小板抗原和白细胞抗原的基因分型检测方法，该方法具有覆盖全、操作简便，高通量和准确率高等优势。具体的，本专利技术提供如下的技术方案：
2、本专利技术的第一个方面，提供一种用于针对选择性输血相关的基因分型检测引物组，所述引物组包括如seq id no.1-82所示序列。
3、本专利技术的第二个方面，提供一种选择性输血相关多种血细胞抗原的一体式基因分型方法，所述方法包括：
4、(4)利用多重pcr扩增在一管中实现多个选择性输血相关抗原的编码基因关注区域的富集；
5、(5)应用上述所富集的核酸片段，进行二代或三代测序文库构建；
6、(6)对相关血细胞抗原的基因进行分型。
7、其中，所述选择性输血相关抗原的编码基因包括itgb3、gp1ba、gp1bb、itga2b、itga2、cd109、gp9、hla-a、-b、-c、-drb1、-dqb1、abo、fut1、fut2、rhd、rhce和cd36。
8、在一种实施方式中，步骤(1)中所述多重pcr扩增使用的引物混合物为长片段扩增试剂，扩增长度范围为1kb-35kb，优选2kb-10kb，进一步优选3kb-7kb；长片段扩增试剂能扩增的目的片段的重数范围为1-500重(pcr产物个数)，优选10-400重，进一步优化为100-200重。
9、在一种优选的实施方式中，所述引物为如seq id no.1-82所示序列。
10、在一种实施方式中，所述方法具体包括以下步骤：
11、(1)以提取自样品的核酸为模板，分别与核苷酸序列如seq id no.1～seq idno.82所示的引物组配制扩增体系，进行第一扩增反应，得第一扩增产物；
12、(2)将第一扩增产物片段化及末端修复补平加a尾；
13、(3)对步骤(2)的产物进行接头连接后纯化；
14、(4)对纯化产物进行测序，得到相关血细胞抗原的基因分型结果。
15、具有良好的扩增效率和特异性，且在多重引物扩增时，引物之间不会出现相互干扰的情况。通过调整扩增引物比例，使各基因的关注区域均能达到有效的多重覆盖，以保证基因分型的准确性。
16、相对于现有技术，本专利技术取得了如下有益的技术效果：
17、1.本专利技术所述的基因分型方法是以dna序列为基础的涉及输血相关的多个红细胞、血小板和白细胞抗原编码基因的一体式分型方法，可降低同种免疫所致异种抗原致敏率的发生率，促进精准输血；支持临床复杂病例输血配型：适用于需要高度匹配血液产品的复杂病例，如高风险妊娠中胎儿新生儿免疫性血小板减少症(fnait)和免疫性血小板减少症患者；
18、2.本专利研发涵盖的血型基因包括：abo、rhd、rhce、hpa(itgb3、gp1ba、gp1bb、itga2b、itga2、cd109、gp9)、hla-a、-b、-c、-drb1、-dqb1、abo、fut1、fut2等，所覆盖的等位基因可达几万种之多；
19、3.本专利技术方法还可兼顾二代和三代测序优势：所搭建平台后续既能进行二代测序文库构建，也能进行三代测序文库构建，为将来血型基因中多位点变异的单倍型确认提供了一个优良的再创造和再生产平台，对将来精准输血具有重要意义。
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1.一种用于针对选择性输血相关的基因分型检测引物组，其特征在于，所述引物组包括如SEQ ID NO.1-82所示序列。
2.一种选择性输血相关多种血细胞抗原的一体式基因分型方法，其特征在于，所述方法包括：
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述选择性输血相关抗原的编码基因包括ITGB3、GP1BA、GP1BB、ITGA2B、ITGA2、CD109、GP9、HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1、ABO、FUT1、FUT2、RhD、RhCE和CD36。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述多重PCR扩增使用的引物混合物为长片段扩增试剂，扩增长度范围为1kb-35kb，优选2kb-10kb，进一步优选3kb-7kb；长片段扩增试剂能扩增的目的片段的重数范围为1-500重(PCR产物个数)，优选10-400重，进一步优化为100-200重。
5.如权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，所述引物为如SEQ ID NO.1-82所示序列。
6.如权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，所述方
...【技术特征摘要】
1.一种用于针对选择性输血相关的基因分型检测引物组，其特征在于，所述引物组包括如seq id no.1-82所示序列。
2.一种选择性输血相关多种血细胞抗原的一体式基因分型方法，其特征在于，所述方法包括：
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述选择性输血相关抗原的编码基因包括itgb3、gp1ba、gp1bb、itga2b、itga2、cd109、gp9、hla-a、-b、-c、-drb1、-dqb1、abo、fut1、fut2、rhd、rhce和cd36。
4...
【专利技术属性】
技术研发人员：周晓阳，蔡剑平，秦闯华，朱发明，文心美，唐薇，徐根明，张志欣，
申请(专利权)人：北京医院，
类型：发明
国别省市：
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