【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种间充质干细胞源的细胞内纳米囊泡在神经保护方面的应用，特别是间充质干细胞来源的细胞内纳米囊泡在神经损伤和神经变性的治疗中的应用。
技术介绍
1、神经系统是机体内对生理功能活动的调节起主导作用的系统，主要由神经组织组成，分为中枢神经系统和周围神经系统两大部分。中枢神经系统（central nervoussystem, cns）包括脑和脊髓，其神经元通常在受伤后无法再生，从而导致神经功能的丧失。脑神经损伤主要导致神经退行性疾病（如帕金森病、阿尔兹海默病、亨廷顿病等）、创伤性脑损伤和脑缺血损伤等疾病，脊髓损伤则往往导致病人出现明显的肢体感觉及运动功能障碍。视神经通常被认为是中枢神经系统的一部分，其由视网膜神经节细胞(rgcs)的轴突组成，可以将视网膜收集到的视觉信息传递至大脑皮层。青光眼，眼外伤，肿瘤性病变，药物中毒都可能导致视神经的损害，一旦视神经受到损伤，往往造成视觉下降，色觉减弱，甚至视力丧失。鉴于中枢神经系统神经元的不可再生性和神经损伤后严重的功能障碍，寻找新的神经治疗策略对于探究中枢神经损伤修复机制及促进中枢神经再生具有重要意义。
2、间充质干细胞（mesenchymal stem cells，mscs）的细胞疗法已成为神经系统疾病的一种有前途的治疗手段。这种治疗方法取决于间充质干细胞转分化为神经细胞的能力，以及它们的自我更新潜力、促增殖特性和神经保护作用。然而，细胞治疗在神经系统疾病的应用存在较多瓶颈，比如细胞异常生长和免疫排斥等问题。研究发现，间充质干细胞分泌的细胞外囊泡（ext
3、值得注意的是，在细胞内还有许多纳米级别的囊泡，它们位于富含膜的多种细胞器之间，负责细胞内物质运输和分泌途径。这些细胞内囊泡（intracellularnanovesicles, ivs）通过一种被称为小泡出芽的过程产生，可以起源于各种细胞器，包括内质网、高尔基体、内体和质膜。它们由多种富膜颗粒组成，如构成型分泌囊泡、突触囊泡、cop包被的囊泡、高尔基体衍生的囊泡、网格蛋白包被的囊泡、内质网和高尔基体之间的运输囊泡等。这些ivs维持了细胞内的基础生命活动，其内含有大量的生物大分子，其通过胞吐作用参与特定蛋白质、激素和其他生物分子的分泌。
4、本专利技术的专利技术人发现，这些细胞内纳米囊泡不仅可以代替细胞发挥治疗作用，而且在神经保护方面具有潜在的应用价值。然而，既往研究主要聚焦于细胞内纳米囊泡介导物质运输的信号传递及调控，现有技术中尚无细胞内纳米囊泡用于神经保护的相关报道。
技术实现思路
1、为克服现有技术的不足，本专利技术提供了一种间充质干细胞来源的细胞内纳米囊泡在神经保护方面（特别是神经损伤和神经变性保护方面）的应用。
2、在本专利技术的第一方面，提供一种间充质干细胞来源的细胞内纳米囊泡在制备预防和/或治疗神经系统疾病的药物中的应用。
3、具体地，所述囊泡为小细胞内纳米囊泡（small intracellular vesicles,sivs）。
4、具体地，所述囊泡呈双层马蹄形或茶杯型。
5、具体地，所述囊泡的平均粒径为50-100nm（例如50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100nm），特别是65-85nm。
6、具体地，所述囊泡表达tmem214蛋白。
7、具体地，所述囊泡低表达外泌体标志物，高表达细胞内富膜细胞器的标志蛋白和clathrin蛋白家族。
8、具体地，所述囊泡在-80℃至37℃（例如-80、-50、-20、-10、0、5、25、37℃）下均较稳定。
9、具体地，所述囊泡通过包含超声处理步骤的方法制得。更具体地，所述囊泡通过包含超声处理、离心处理、超速离心处理步骤（依次进行）的方法制得。
10、在本专利技术的一个优选实施方式中，所述囊泡通过包含以下步骤的方法制得：
11、（1）取间充质干细胞分散在悬浮溶剂中，进行超声处理；
12、（2）将步骤（1）所得液体进行一次或多次离心处理，弃去细胞膜及细胞器碎片，取上清液；
13、（3）将步骤（2）所得上清液进行超速离心处理，取沉淀为细胞内纳米囊泡；
14、任选地，（4）将步骤（3）所得沉淀重悬。
15、具体地，步骤（1）中所述细胞为经过培养、消化、洗涤后所得分离的细胞（其经过弃去细胞培养基、消化、洗涤等步骤，可排除分离获得细胞外囊泡的可能性）。
16、具体地，所述方法还可以包括细胞消化、计数步骤；在本专利技术的一些实施方案中，所述细胞消化的步骤包括：培养细胞生长至90%融合，弃去细胞培养基，洗涤细胞，加入胰酶消化细胞，然后中和并清洗细胞。
17、具体地，所述细胞在悬浮溶剂中的细胞密度为1-4×106个/ml，例如1×106个/ml、2×106个/ml、3×106个/ml、4×106个/ml。在本专利技术的一些实施方案中，所述细胞密度为1×106个/ml。
18、具体地，所述悬浮溶剂为任何适于培养细胞的缓冲液，例如pbs、tris缓冲液、甘氨酸缓冲液。在本专利技术的一些实施方案中，所述溶剂为pbs。
19、具体地，所述间充质干细胞来源于哺乳动物，特别是人类。
20、具体地，所述间充质干细胞选自：脐带间充质干细胞（uc-msc）、骨髓间充质干细胞（bm-msc）、脂肪间充质干细胞（ad-msc）、牙髓间充质干细胞、胎盘和羊水以及羊膜间充质干细胞，特别是脐带间充质干细胞（uc-msc）。
21、具体地，步骤（1）中所述超声处理的振幅为20%-35%（例如20%、22%、24%、25%、30%、35%），优选为20%-25%；在本专利技术的一些实施方案中，所述超声处理的振幅为20%。
22、具体地，步骤（1）中所述超声处理的时间为15-60s（例如15、20、25、30、40、50、60s），优选为15s；在本专利技术的一些实施方案中，所述超声处理的时间为15s，on 2s，off 2s。
23、具体地，步骤（1）中所述超声处理的时间为10-20s（例如10、15、18、20s）。
24、在本专利技术的一些实施方案中，步骤（2）中所述离心处理的次数为两次，其各自参数分别为：
25、1000-3000g（例如1000、1500、2000、2500、3000g），5-20分钟（例如5、8、10、12、15、20分钟）；
26、10000-30000g（例如10000、15000、20000、25000、30000g），20-40分钟（例如20、25、28、30、32、35、40分钟）。
27、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种间充质干细胞来源的细胞内纳米囊泡在制备预防和/或治疗神经系统疾病的药物中的应用；
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（1）中所述超声处理的振幅为20%-25%；和/或，所述超声处理的时间为10-20s。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（1）中所述超声处理的振幅为20%；和/或，所述超声处理的时间为15s，运行 2s，暂停 2s。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（2）中所述离心处理的次数为两次，其各自参数分别为：1000-3000g，5-20分钟；10000-30000g，20-40分钟；和/或，
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞选自：脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、胎盘和羊水以及羊膜间充质干细胞。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述囊泡的平均粒径为50-100nm。
7.如权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述神经系统疾病选自：视神经疾病、脑血管疾病、创伤性脑损伤疾病、神经系统退行
8.如权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述神经系统疾病为视神经疾病。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述视神经疾病为视神经损伤。
10.如权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述神经系统疾病为缺血性脑血管疾病。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述缺血性脑血管疾病为脑梗死。
12.如权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述神经系统疾病为神经系统退行性疾病。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述神经系统退行性疾病为阿尔兹海默病或帕金森病。
14.如权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型选自：口服给药剂型、注射给药剂型、皮下给药剂型、皮肤给药剂型、眼部给药剂型、鼻部给药剂型。
15.如权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为玻璃体腔注射剂、鼻腔给药剂、静脉注射剂或腹腔注射剂。
16.如权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述药物为霜、泡沫、膏、软膏、乳剂、液体溶液、滴眼剂、注射剂、粉针剂、凝胶、喷雾、悬浮液、微乳液、眼罩或隐形眼镜。
...【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞来源的细胞内纳米囊泡在制备预防和/或治疗神经系统疾病的药物中的应用；
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（1）中所述超声处理的振幅为20%-25%；和/或，所述超声处理的时间为10-20s。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（1）中所述超声处理的振幅为20%；和/或，所述超声处理的时间为15s，运行 2s，暂停 2s。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（2）中所述离心处理的次数为两次，其各自参数分别为：1000-3000g，5-20分钟；10000-30000g，20-40分钟；和/或，
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞选自：脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、胎盘和羊水以及羊膜间充质干细胞。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述囊泡的平均粒径为50-100nm。
7.如权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述神经系统疾病选自：视神经疾病、脑血管疾病、创伤性脑损伤疾病、神经系统退行性疾病。
8.如权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：张晓敏，张咪，樊蕊嫣，张慧，李嘉仪，李筱荣，
申请(专利权)人：天津医科大学眼科医院，
类型：发明
国别省市：
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