【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，特别是涉及pub62基因在调控植物抗双生病毒中的应用及转基因植物培育方法。
技术介绍
1、双生病毒是世界范围内广泛发生的单链环状dna病毒，是目前为止种类最多的植物病毒，包含了520多种，危害木薯、玉米、番茄等作物会后引起严重的减产，甚至绝产。作为单链dna病毒，双生病毒通过重组依赖型复制或者滚环复制的方式在寄主的细胞核中进行复制。研究表明，重组是驱动双生病毒进化的一个重要因素。重组所产生的新的病毒往往具有更强的致病性，一旦引入或入侵至新的国家和地区，将对病害的防控造成新的挑战。
2、大豆黄化曲叶病毒(sbylcv)又称大豆症青相关双生病毒，是近年来新鉴定的一类严重威胁大豆生产的新型重组双生病毒。大豆植株被侵染后表现叶片上卷，植株该成熟时，叶片持绿且出现荚而不实或瘪粒的症状。该病毒目前广泛分布于我国的黄淮海等大豆主产区，对大豆的稳产造成了严重的威胁。种植抗病品种是防控双生病毒最经济有效的手段，但是目前尚未报道抗sbylcv的大豆品种。因此，挖掘植物抗sbylcv侵染的寄主因子，并评估其对几种不同类型的双生病毒的抗性对于加快抗双生病毒的分子育种工程，有效控制双生病毒的侵染具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术的第一目的是提供pub62基因在调控植物抗双生病毒中的应用。
2、本专利技术的第二目的是提供一种pub62基因转基因植物的培育方法。
3、本专利技术通过前期实验发现了一个抵抗sbylcv侵染的寄主因子，并通过获取其
4、具体而言，本专利技术采用的具体技术方案如下：
5、pub62基因在调控植物抗双生病毒中的应用，其中，所述双生病毒为大豆黄化曲叶病毒、番茄黄化曲叶病毒和云南番茄曲叶病毒；所述pub62基因的转录本序列如seq id no:1所示。
6、具体为，通过农杆菌介导的转化方法，将带有黄色荧光蛋白的nbpub62-yfp载体导入目的植物中，获得的nbpub62高表达植物能够显著减轻大豆黄化曲叶病毒、番茄黄化曲叶病毒和云南番茄曲叶病毒的侵染。
7、一种抗多种双生病毒的pub62转基因植物的培育方法：通过农杆菌转化的方法，将pub62基因导入目的植物中，获得本氏烟pub62基因高表达植物。
8、具体包括以下的步骤：
9、(1)获得本氏烟植株，利用trizol法从本氏烟植株叶片中抽提rna，通过反转录获得cdna；
10、(2)以本氏烟cdna为模板，使用引物对nbpub62-f与nbpub62-r，如seq id no:2-3所示，进行pcr扩增，得到nbpub62片段，所使用的引物序列为：
11、nbpub62-f：ccttaattaacatggcttctgaagaaatggg
12、nbpub62-r：ttggcgcgccccagccaattggcagccgtctta
13、(3)将nbpub62构建到带有黄色荧光标签的载体上，获得nbpub62-yfp重组质粒；
14、(4)将1μg重组质粒与100μl农杆菌感受态混合转入电击杯中，通过冻融法转化农杆菌，恢复培养2小时后涂布到相应抗性培养基上，28℃培养48小时后筛选获得带有nbpub62-yfp重组质粒的农杆菌；
15、(5)将带有重组质粒的农杆菌侵染烟草叶片，经分化培养获得愈伤组织，再经生根培养获得t0代幼苗，转移继续培养；
16、(6)继续培养的小苗生长稳定后，利用ctab法抽提植物叶片中的dna；使用引物对35s-f与nbpub62-r，如seq id no:4及seq id no:3所示，以提取的dna为模板进行pcr扩增，确定重组质粒nbpub62-yfp是否成功转化；所使用的引物序列为：
17、35s-f：ccttcgcaagacccttcctc
18、nbpub62-r：ttggcgcgccccagccaattggcagccgtctta
19、对以上植物样品抽提总蛋白，进行sds-page凝胶电泳，再使用gfp抗体进行western blot确定植物表达了nbpub62-yfp重组蛋白，对以上阳性烟草植株收取t1代种子。
20、(7)利用农杆菌介导的接种法将大豆黄化曲叶病毒、番茄黄化曲叶病毒和云南番茄曲叶病毒的侵染性克隆接种nbpub62-yfp转基因烟草，对转基因烟草的抗病性进行鉴定。
21、同现有技术相比，本专利技术的突出效果在于：
22、本专利技术克隆了本氏烟中pub62基因，通过生物信息学分析和分子生物学实验确定pub62对大豆黄化曲叶病毒侵染具有抗性，通过农杆菌介导的遗传转化，将pub62基因导入目的植物中，获得pub62高表达转基因植物。获得的pub62转基因植物能够显著抑制大豆黄化曲叶病毒的侵染，同时也能显著抑制番茄黄化曲叶病毒和云南番茄曲叶病毒的侵染，有利于后续科学研究和田间应用。
23、下面结合附图说明和具体实施例对本专利技术所述的pub62基因在调控植物抗双生病毒中的应用及转基因植物培育方法作进一步说明。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.PUB62基因在调控植物抗双生病毒中的应用，其特征在于：所述PUB62基因的转录本序列如SEQ ID NO:1所示；所述双生病毒为大豆黄化曲叶病毒、番茄黄化曲叶病毒和云南番茄曲叶病毒。
2.根据权利要求1所述PUB62基因在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：通过农杆菌介导的遗传转化方法，将NbPUB62-YFP载体导入烟草中进行遗传转化，获得NbPUB62过表达转基因植物；获得的NbPUB62过表达转基因植物能够显著抑制大豆黄化曲叶病毒、番茄黄化曲叶病毒和云南番茄曲叶病毒的侵染。
3.一种抗多种双生病毒的NbPUB62转基因植物的培育方法，其特征在于：通过农杆菌转化的方法，将NbPUB62基因导入目的植物中，获得NbPUB62高表达的转基因本氏烟植物。
4.根据权利要求3所述的NbPUB62转基因植物的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：
【技术特征摘要】
1.pub62基因在调控植物抗双生病毒中的应用，其特征在于：所述pub62基因的转录本序列如seq id no:1所示；所述双生病毒为大豆黄化曲叶病毒、番茄黄化曲叶病毒和云南番茄曲叶病毒。
2.根据权利要求1所述pub62基因在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：通过农杆菌介导的遗传转化方法，将nbpub62-yfp载体导入烟草中进行遗传转化，获得nbpub62过表达转基因植物；获...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨秀玲，周雪平，杜敏，许雅楠，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。