【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及单克隆抗体制备，特别涉及一种pedv n蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
1、猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，ped)是猪感染猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)所引起的一种高度接触性传染病，主要临床症状表现为急性腹泻、脱水、呕吐、急性肠炎等。该病毒具有发病突然、传播快、流行范围广泛等特点，其可感染所有年龄段的猪，对两周龄以内的未断乳猪仔危害最大，可导致90～100％的死亡率。目前世界上养猪的国家均有该病的报道，其中最严重的是欧洲和亚洲国家，对各地养殖业造成了严重的经济损失。
2、pedv是套病毒目，冠状病毒科，冠状病毒属成员，基因组全长约28kb，由2个非结构蛋白和4个结构蛋白组成。pedv核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，n蛋白)是pedv的结构蛋白之一，是冠状病毒的核心组成部分。该蛋白对诱导感染机体的细胞免疫具有重要作用，在病毒感染早期可刺激机体产生体液免疫，诱导机体产生大量抗n蛋白抗体。pedv n蛋白是早期检测pedv感染的重要靶蛋白，也是一种重要的抗原。因此其常被应用于血清学检测。这需要性能优异pedv n单克隆抗体作为基础，相应的，就必须建立稳定生产单抗的细胞株，而能否构建适宜的细胞株，又有赖于有效pedv n重组蛋白及其单克隆抗体制备方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提出一种pedv n蛋白单克隆抗体及其制备
2、第一方面，本专利技术提出一种pedv n蛋白单克隆抗体的制备方法，所述制备方法包括：
3、对pedv n蛋白进行原核表达，并利用his标签镍柱亲和层析柱纯化，以获得提纯后的pedv n蛋白；
4、将纯化后的pedv n蛋白与等体积弗氏佐剂乳化，多点位注射8周龄的雌性balb/c小鼠，两周免疫一次，免疫3次；
5、按5：1比例取已加强免疫3天后的小鼠的脾细胞与对数生长期的sp2/0细胞混合均匀，在peg1500作用下进行细胞融合，融合后的细胞混合液加到提前一天制备好的饲养细胞内，使用hat培养基培养；
6、采用间接elisa方法筛选出分泌抗体能力强的阳性孔，并采用有限稀释法进行亚克隆，获得6株分泌抗体的细胞株；
7、采用体内诱生腹水法对pedv n蛋白mab进行制备。
8、进一步地，所述对pedv n蛋白进行原核表达的步骤包括：
9、利用pedv n特异性引物以pedv毒株感染的鸡胚尿囊液抽提的核酸为模板，经rt-pcr方法扩增获得pedv n基因；
10、将pedv n基因利用同源重组方式整合到质粒载体中，获得重组质粒；
11、将重组质粒转化到宿主菌bl21中，获得菌液；
12、从菌液中筛选携带pedv n基因的重组菌，并在iptg诱导下表达pedv n蛋白。
13、进一步地，pedv n蛋白的核苷酸序列如seq id no.1所示。
14、进一步地，pedv n蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
15、进一步地，扩增的引物对的核苷酸序列如seq id no.3和seq id no.4所示。
16、进一步地，所述质粒载体为pcold iii，所述质粒载体上带有his标签和冷休克诱导型启动子，利用低温诱导减少蛋白过快折叠形成包涵体，从而增加蛋白的可溶性表达。
17、进一步地，所述将pedv n基因利用同源重组方式整合到质粒载体中，获得重组质粒的步骤包括：
18、利用全式金的同源重组酶将pedv n基因克隆到原核表达载体pcold iii中，转化大肠杆菌感受态细胞dh5α中，并经质粒测序验证后转化原核表达菌株bl21中获得带pedv n基因的重组表达菌。
19、进一步地，所述对pedv n蛋白进行原核表达，并利用his标签镍柱亲和层析柱纯化，以获得提纯后的pedv n蛋白的步骤包括：
20、利用his标签镍柱亲和层析柱纯化获得上清蛋白；
21、将蛋白上清加入his标签镍柱亲和层析柱中，4℃孵育过夜；
22、使用10mm咪唑洗涤液洗脱杂蛋白，100mm洗脱目的蛋白；
23、洗脱获得的pedv n蛋白经超滤管离心去除咪唑。
24、第二方面，本专利技术还提出一种pedv n蛋白单克隆抗体，所述pedv n蛋白单克隆抗体根据上述的pedv n蛋白单克隆抗体的制备方法制得。
25、第三方面，本专利技术还提出一种pedv n蛋白单克隆抗体在pedv病毒抗感染中的应用。
26、综上，根据上述的pedv n蛋白单克隆抗体的制备方法，制备得到的pedv n蛋白单克隆抗体均可特异性高效结合，可作为pedv病毒感染和抗感染机制研究的抗体工具，此外，制备的单克隆抗体满足作为免疫层析试纸条开发的原料要求。
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1.一种PEDV N蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
2.根据权利要求1所述的PEDV N蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述对PEDVN蛋白进行原核表达的步骤包括：
3.根据权利要求2所述的PEDV N蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，PEDV N蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求2所述的PEDV N蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，PEDV N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求2所述的PEDV N蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，扩增的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
6.根据权利要求2所述的PEDV N蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述质粒载体为pColdIII，所述质粒载体上带有His标签和冷休克诱导型启动子。
7.根据权利要求2所述的PEDV N蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述将PEDVN基因利用同源重组方式整合到质粒载体中，获得重组质粒的步
8.根据权利要求2所述的PEDV N蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述对PEDVN蛋白进行原核表达，并利用HIS标签镍柱亲和层析柱纯化，以获得提纯后的PEDV N蛋白的步骤包括：
9.一种PEDV N蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述PEDV N蛋白单克隆抗体根据权利要求1-8任一项所述的PEDV N蛋白单克隆抗体的制备方法制得。
10.一种如权利要求9所述的PEDV N蛋白单克隆抗体在PEDV病毒抗感染中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种pedv n蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
2.根据权利要求1所述的pedv n蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述对pedvn蛋白进行原核表达的步骤包括：
3.根据权利要求2所述的pedv n蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，pedv n蛋白的核苷酸序列如seq id no.1所示。
4.根据权利要求2所述的pedv n蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，pedv n蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
5.根据权利要求2所述的pedv n蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，扩增的引物对的核苷酸序列如seq id no.3和seq id no.4所示。
6.根据权利要求2所述的pedv n蛋白单克隆抗体的...
【专利技术属性】
技术研发人员：李红梅，陈瑞爱，熊挺，申瀚钦，赵希雅，梁雪静，刘定祥，
申请(专利权)人：岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心，
类型：发明
国别省市：
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