【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体地说，涉及一种dna分子、含有其的重组载体、杆状病毒及其制备方法与在制备禽法氏囊病毒和ⅰ群4型禽腺病毒疫苗中的应用。
技术介绍
1、鸡传染性法氏囊病（infectious bursal disease，ibd）是由鸡传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，ibdv)引起的一种急性、高度接触性传染病，该病毒主要侵害雏鸡和青年鸡的淋巴组织，尤其是法氏囊等中枢免疫器官，可造成法氏囊组织出现严重病理损伤，进而导致机体发生严重的免疫抑制，极易导致继发感染或使多种疫苗免疫失败，给养鸡业造成巨大的损失。
2、ibdv属于双股rna病毒科双股rna病毒属，基因组由两个双链rna片段组成，分别为a片段和b片段，a片段由约3.3kb核苷酸组成，含2个开放阅读框架，分别编码分子量约110ku的前体多聚蛋白（n-vp2-vp4-vp3-c）和vp5，其中前体蛋白通过翻译后加工修饰成为成熟的vp2、vp3、vp4蛋白；b片段长约2.9kb，编码vp1。主要的结构蛋白vp2也是病毒核衣壳的主要成分，其具有构象依赖性（不连续）的中和抗原决定簇，诱导的中和抗体能被动地保护宿主不受ibdv感染，是ibdv的宿主保护性抗原，其研究对于ibdv的遗传变异及免疫防控等均具有重要作用。
3、禽腺病毒（fowl adenovirus，fadv），属于禽腺病毒科禽腺病毒属，是各地常见的禽类传染病病原之一。根据抗原特性，禽腺病毒目前可分为ⅰ、ⅱ、ⅲ共三个种群，其中ⅰ群可分为五个种，十二
4、ⅰ群腺病毒具有较为复杂的传播方式，可迅速传播与流行，夏季多发，死亡率高。因此，腺病毒疫苗的研发工作势在必行。
5、目前预防禽法氏囊病毒和禽腺病毒感染仍以传统弱毒苗和灭活苗为主，由于制备体系的差别，其疫苗免疫效力及生物安全性也有所差别。对于如何同时提供针对这两种病毒的保护，仍有待进一步研究。
技术实现思路
1、本专利技术的目的之一在于提供一种可同时高效表达禽法氏囊病毒vp2抗原蛋白和ⅰ群4型禽腺病毒fiber-2抗原蛋白的方法。
2、具体地，本专利技术提供了一种dna分子，其包括顺序连接的白蛾多角体病毒ie0基因、禽法氏囊病毒vp2基因和ⅰ群4型禽腺病毒fiber-2基因；
3、所述白蛾多角体病毒ie0基因的序列如seq id no.3所示；
4、所述禽法氏囊病毒vp2基因的序列如seq id no.1所示；
5、所述ⅰ群4型禽腺病毒fiber-2基因的序列如seq id no.2所示。
6、本专利技术选择特定的禽法氏囊病毒vp2基因和ⅰ群4型禽腺病毒fiber-2基因，并将它们分别进行特定的密码子适应性优化后，以特定顺序与增强表达效率的白蛾多角体病毒ie0基因进行连接，从而可使用bac-to-bac杆状病毒表达系统同时高效表达禽法氏囊病毒vp2抗原蛋白和ⅰ群4型禽腺病毒fiber-2抗原蛋白。
7、本专利技术中，优选以含有上述dna分子的重组杆状病毒转染细胞后，进行培养，经三次传代，两次细胞彻底冻融破碎，离心取上清，可获得重组杆状病毒表达蛋白混合物。
8、若换用其他优化获得的基因序列，或者调整各基因的连接顺序则无法同时高效表达两种抗原蛋白。且以本专利技术dna分子同时表达获得的亚单位蛋白具有自行组装成vlp的特性，可有助于提升免疫原性、安全性和稳定性。若改变具体各基因的序列则无法获得理想的效果。
9、本专利技术还提供一种dna分子，其核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2或seqid no.3所示。
10、以本专利技术的上述dna分子，进行组合可用于同时高效表达禽法氏囊病毒vp2抗原蛋白和ⅰ群4型禽腺病毒fiber-2抗原蛋白。
11、本专利技术还提供含有上述dna分子的生物材料，所述生物材料为表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
12、本专利技术还提供一种制备重组载体的方法，其采用pfastbac dual作为载体，将禽法氏囊病毒vp2基因插入到所述载体的pme i和hind iii限制性内切酶的酶切位点之间，得到插入禽法氏囊病毒vp2基因的重组质粒载体，命名为pdual-vp2；
13、将白蛾多角体病毒ie0基因和pdual-vp2，使用aclⅰ和ncoⅰ进行双酶切后，进行酶连，得到同时插入禽法氏囊病毒vp2基因和白蛾多角体病毒ie0基因的重组质粒载体，命名为pdual-ie-vp2；
14、将ⅰ群4型禽腺病毒fiber-2基因插入到pfastbac dual的bam hi和xhoi酶切位点之间，得到插入ⅰ群4型禽腺病毒fiber-2基因的重组质粒载体，命名为pdual-fiber2；
15、将pdual-ie-vp2重组质粒载体和pdual-fiber2重组质粒载体分别使用nrui和avrii进行双酶切，然后进行混合酶连；
16、所述白蛾多角体病毒ie0基因、禽法氏囊病毒vp2基因和ⅰ群4型禽腺病毒fiber-2基因的序列如上所述；
17、优选，用于扩增所述白蛾多角体病毒ie0基因、禽法氏囊病毒vp2基因和ⅰ群4型禽腺病毒fiber-2基因的引物序列如seq id no.4-9所示。
18、本专利技术的重组载体中，启动子依次启动白蛾多角体病毒ie0基因、禽法氏囊病毒vp2基因和ⅰ群4型禽腺病毒fiber-2基因的转录。优选以pfastbac dual为载体。
19、本专利技术还提供一种制备重组杆状病毒的方法，其包括：
20、1）将上述dna分子克隆至大肠杆菌dh10 bac感受态细胞中，经过筛选鉴定，得到重组杆状病毒bacmid；
21、优选，采用上述方法制备的重组载体转化大肠杆菌dh10 bac感受态细胞，以将上述dna分子克隆至大肠杆菌dh10 bac感受态细胞中；
22、2）将步骤1）筛选所得的重组杆状病毒bacmid转染sf9细胞，经培养后收获重组杆状病毒。
23、本专利技术还提供一种重组杆状病毒，其由上述方法制备得到；或者，所述重组杆状病毒的保藏编号为cctcc no:v202449。
24、本专利技术提供按照上述方法构建得到的rbac-ie-vp2-fiber2基因工程毒株（银蚊夜蛾核型多角体病毒rbac-ie-vp2-fiber2 autographa californica multiplenuclecopolyhedrovirus），该毒株现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号cctcc no:v202449，保藏日期2024年4月23日。
25、本专利技术的重组杆状病毒能够同时高效表达禽法氏囊病毒vp2抗原本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种DNA分子，其特征在于，包括顺序连接的白蛾多角体病毒IE0基因、禽法氏囊病毒VP2基因和Ⅰ群4型禽腺病毒Fiber-2基因；
2.一种DNA分子，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ IDNo.3所示。
3.含有权利要求1或2所述的DNA分子的生物材料，所述生物材料为表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
4.一种制备重组载体的方法，其特征在于，采用pFastBac Dual作为载体，将禽法氏囊病毒VP2基因插入到所述载体的Pme I和Hind III限制性内切酶的酶切位点之间，得到插入禽法氏囊病毒VP2基因的重组质粒载体，命名为pDual-VP2；
5.一种制备重组杆状病毒的方法，其特征在于，包括：
6.一种重组杆状病毒，其特征在于，由权利要求4所述的方法制备得到；或者，所述重组杆状病毒的保藏编号为CCTCC NO:V202449。
7.一种制备权利要求6所述的重组杆状病毒的病毒培养液方法，其特征在于，包括：
8.一种病毒培养液，其特
9.权利要求1或2所述的DNA分子或权利要求3所述的生物材料或权利要求4所述的制备重组载体的方法或权利要求5所述的制备重组杆状病毒的方法或权利要求6所述的重组杆状病毒或权利要求7所述的制备权利要求6所述的重组杆状病毒的病毒培养液的方法或权利要求8所述的病毒培养液在制备疫苗中的应用。
10.一种疫苗，其特征在于，包括权利要求8所述的病毒培养液。
...【技术特征摘要】
1.一种dna分子，其特征在于，包括顺序连接的白蛾多角体病毒ie0基因、禽法氏囊病毒vp2基因和ⅰ群4型禽腺病毒fiber-2基因；
2.一种dna分子，其特征在于，核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2或seq idno.3所示。
3.含有权利要求1或2所述的dna分子的生物材料，所述生物材料为表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
4.一种制备重组载体的方法，其特征在于，采用pfastbac dual作为载体，将禽法氏囊病毒vp2基因插入到所述载体的pme i和hind iii限制性内切酶的酶切位点之间，得到插入禽法氏囊病毒vp2基因的重组质粒载体，命名为pdual-vp2；
5.一种制备重组杆状病毒的方法，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁野，孙灵睿，周蕾蕾，陈秋阁，朱昊敏，李吉轩，王飞，李海鹰，程海波，张秀美，
申请(专利权)人：乾元浩生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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