一种对质粒模板的polyA序列丢失程度进行检测的方法及应用技术

技术编号：44462010 阅读：0 留言：0更新日期：2025-03-04 17:36

本发明专利技术公开了一种对质粒模板的polyA序列丢失程度进行检测的方法及其在对体外转录制备的mRNA产品进行质控中的应用，所述方法包括：在所述polyA序列包含的间隔序列中插入限制性酶切位点E1，并针对E1和所述质粒模板中包含的与E1不同的另外的酶切位点E进行酶切，基于酶切产物的电泳或HPLC结果来检测E1的完整性，从而检测polyA序列的完整性。比起传统的用于对polyA完整性进行检测的sanger测序，该方法不依赖特殊的测序设备，可在1‑2小时内出结果，并且可针对polyA的完整性进行定量或者半定量的分析。该方法对于确保DNA质粒模板的良好的质量和体外转录得到的mRNA的完整的生物学功能具有重要的实用价值。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因体外转录产物的质量控制领域，牵涉到利用质粒模板通过体外转录制备mrna药物的过程。更具体的说，本专利技术涉及针对dna质粒模板的polya序列的完整性(丢失程度)进行检测的方法以及该方法在对通过体外转录制备的mrna产品进行质控中的应用。

技术介绍

1、mrna药物是生物制药领域重要的研究对象。制备mrna药物主要通过体外转录。体外转录是在一定的条件下，依据dna质粒模板提供的序列，通过rna聚合酶催化核糖核酸碱基进行聚合反应生成mrna。大多数mrna的序列需要一定长度(70～150bp不等)的多聚腺苷酸(polya)尾，以维持mrna在细胞内的稳定性和正常的蛋白翻译功能。mrna的polya是以dna质粒(在本文中也称为“质粒”或“质粒模板”)上的polya序列(在本文中也称“质粒polya”)作为模板转录生成的。

2、在质粒的大规模制备即扩大培养过程中，polya序列的长度会随着宿主细菌的扩增而缩短甚至丢失，进一步会导致体外转录的mrna序列的polya缩短或丢失，从而影响mrna的细胞功能。基于此现象，目前有报道称质粒polya序列丢失的问题可以通过在polya序列中引入间隔序列(spacer sequence)部分进行解决。

3、但是，在具体的实践中polya丢失的现象无法完全避免。目前，检测质粒polya完整性的方法主要有测序以及上下游酶切。这两种方法虽然简单，但是存在如下的局限性：

4、1.测序不能对质粒polya丢失的程度进行定量，只能做定性的检测。

<p>5、2.上下游酶切的方法只能直接检测polya比较完整的质粒，较难直接检测polya序列丢失的质粒，不能对polya丢失程度进行半定量或定量检测。

6、然而，对质粒的polya序列的完整性进行定量或者半定量的分析是评估质粒质量的重要标准，而目前的方法并不能满足这一要求。

技术实现思路

1、本专利技术的专利技术人在研究中发现，polya序列的完整性与在所述polya序列的间隔序列中插入的限制性酶切位点e1的完整性是相关的，可通过针对位点e1的限制性酶切来检测位点e1的完整性，并由此检测polya序列的完整性。基于此，本专利技术提供了一种可对质粒polya丢失程度进行半定量和定量质控(检测)的方法，该方法可以在短的时间(1-2个小时)内完成，而且该方法仅通过普通的酶切和凝胶电泳设备即可实施(如果为了更进一步增加灵敏度和准确度，还可以使用hplc和毛细管电泳设备，但不是必须的)。

2、在一个方面，本专利技术提供了一种对质粒模板的polya序列丢失程度进行检测的方法，包括：

3、(1)在所述polya序列包含的间隔序列中插入限制性酶切位点e1；

4、(2)对所述限制性酶切位点e1和所述质粒模板中包含的与e1不同的另外的酶切位点e进行酶切，得到酶切产物；

5、(3)对所述酶切产物进行电泳或hplc，根据电泳或hplc结果检测所述polya序列是否发生丢失：

6、当对所述酶切产物进行电泳时，基于如下的公式计算所述polya序列的丢失程度：丢失程度＝线性化片段的荧光强度/(双酶切片段的荧光强度之和+线性化片段的荧光强度)×100％；

7、当对所述酶切产物进行hplc时，基于如下的公式计算相对峰面积作为所述polya序列的丢失程度：相对峰面积＝线性化片段的峰面积/(双酶切片段的峰面积之和+线性化片段的峰面积)×100％；

8、其中，当所述限制性酶切位点e1完全丢失时，通过所述酶切仅产生线性化片段；当所述限制性酶切位点e1部分丢失或未丢失时，通过所述酶切产生双酶切片段和可选的线性化片段。

9、另一方面，本专利技术提供了上述方法在对通过体外转录制备的mrna产品进行质控中的应用。

10、本文的检测方法适用于所有的用于体外转录(in vitro transcription)制备mrna并且包含polya尾序列的质粒。本专利技术中的检测方法通过在间隔序列中特意引入限制性酶切位点，从而在实现了通过简单、便捷的手段对polya序列是否发生丢失进行检测的基础上，能够由酶切片段的荧光强度或色谱峰面积计算出丢失程度，由此达到了对质粒的polya序列的完整性进行定量或者半定量分析的效果，最终能够实现对通过体外转录制备的mrna产品(例如mrna药物等)进行质控。相比于传统的采用sanger测序对polya完整性进行检测的方法，本文中的检测方法不依赖特殊的测序设备，可在1-2小时内出结果。

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【技术保护点】

1.一种对质粒模板的polyA序列丢失程度进行检测的方法，包括：

2.如权利要求1所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述polyA序列包含70个以上的腺苷酸；

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述间隔序列的长度为3～30bp；

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述polyA序列包含位于所述间隔序列之前的至少10个、至少20个、至少25个、至少30个、或至少40个连续的腺苷酸；

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述限制性酶切位点E1为NdeI、HindIII、EcoRI、或NcoI酶切位点；

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述限制性酶切位点E1和所述质粒模板中包含的与E1不同的另外的酶切位点E之间间隔的距离使酶切得到的所有酶切片段之间的大小相差不小于700bp。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述另外的酶切位点E为1个或2个；

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，在步骤(3)中，所述电泳包括琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳。>

9.权利要求1-8中任一项所述的方法在对通过体外转录制备的mRNA产品进行质控中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其中，所述mRNA产品具有70bp以上的polyA尾。

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【技术特征摘要】

1.一种对质粒模板的polya序列丢失程度进行检测的方法，包括：

2.如权利要求1所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述polya序列包含70个以上的腺苷酸；

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述间隔序列的长度为3～30bp；

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述polya序列包含位于所述间隔序列之前的至少10个、至少20个、至少25个、至少30个、或至少40个连续的腺苷酸；

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述限制性酶切位点e1为ndei、hindiii、ecori、或ncoi酶切位点；

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【专利技术属性】
技术研发人员：肖伟，张习哲，孙善秋，谭晓芳，王振中，章晨峰，
申请(专利权)人：江苏康缘药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：

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