【技术实现步骤摘要】
本申请涉及生物，具体涉及一种从链霉亲和素磁珠上洗脱生物素标记核酸的方法。
技术介绍
1、染色质免疫沉淀(chip)是广泛用于研究蛋白质与dna相互作用的方法，通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。将chip与大规模平行dna测序技术相结合，可以让研究者精确绘制感兴趣蛋白的全局dna结合位点。若只想研究特定蛋白和特定位点的相互作用，则可将chip与qpcr检测方法相结合。chip的基本流程是：(1)交联：采用甲醛固定组织或细胞，使dna与蛋白质紧密结合；(2)片段化：该过程破坏染色质，最终获得用于chip分析的dna片段与蛋白复合物；(3)染色质免疫沉淀：通过加入针对目的蛋白的抗体，结合靶蛋白-dna复合物；(4)dna回收和纯化：回收纯化富集的dna片段，通过下游检测技术(定量pcr、基因芯片、测序等)分析靶标蛋白特异结合的dna序列信息(park p.j.,etal.chip-seq:advantages and challenges of amaturing technology.nat revgenet.2009；10:669-680.)。然而，因chip技术需要对组织或细胞进行甲醛交联，然后再进行dna片段化，这使得该技术需要极高的细胞起始投入量(百万级)，并且很可能因为甲醛过度交联使实验结果存在假阳性。
2、为了弥补chip的技术缺陷，研究者通过不断的更新与优化，开发了cut&run(cleavage under targets&release using nuclease)
3、虽然cut&tag技术相较chip有明显提升，但是因为cut&tag技术基于tn5酶在目的片段插入扩增接头，其回收全基因组后，通过特殊扩增引物获得靶点dna片段。cut&tag无法直接通过提取获得目的片段，导致cut&tag技术目前并不能兼容qpcr检测方式，这限制了cut&tag技术的广泛应用。
4、国际上虽然有通过将tn5接头进行biotin修饰，再用sa磁珠特异回收tn5酶作用片段的方式，但是其是通过带sa磁珠进行文库扩增，并不兼容qpcr检测(wei y,etal.optimization ofcut&tag product recovery and library construction method.yichuan.2021apr 20；43(4):362-374.)。
技术实现思路
1、本申请的目的在于提供一种从链霉亲和素磁珠上洗脱生物素标记核酸的方法。本申请的方法通过使用包含甲酰胺和sds的洗脱液，能够提高链霉亲和素磁珠的核酸释放效率。进一步地，本申请还优化了cut&tag磁珠回收过程中的结合缓冲液，能够中和前端杂质对qpcr检测方法的抑制，使其能够充分兼容qpcr检测，进而大大提高研究效率和cut&tag技术的应用范围。
2、本申请的第一方面提供一种从链霉亲和素磁珠上洗脱生物素标记核酸的方法，所述方法包括如下步骤：
3、(1)向结合有生物素标记核酸的链霉亲和素磁珠中加入洗脱液，所述洗脱液包含甲酰胺和十二烷基硫酸钠(sds)；
4、(2)混匀，孵育；
5、(3)外加磁场，收集上清。
6、在一些实施方案中，所述孵育是室温孵育，例如室温孵育5-30min，例如室温孵育10-25min，包括所述范围内的10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min和25min。
7、在一些实施方案中，所述步骤(2)还包括在孵育后进行80-95℃热处理，优选85-95℃，包括所述范围内的85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃和95℃。
8、在一些实施方案中，所述热处理包括80-95℃处理1-10min，包括所述范围内的1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min和10min。
9、在一些实施方案中，所述热洗脱是通过水浴加热。
10、在一些实施方案中，所述甲酰胺的浓度是5-30mm，优选5-20mm，包括所述范围内的5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm和20mm。
11、在一些实施方案中，所述sds的浓度(质量体积比，1％＝1g/100ml)是0.1％-10％，优选0.5％-10％，包括所述范围内的0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％和10％。
12、在一些实施方案中，所述洗脱液不包含柠檬酸盐缓冲液(ssc，salinesodiumcitrate)，或所述洗脱液不包含denhardt's溶液，或所述洗脱液不包含ssc和denhardt's溶液。
13、在一些实施方案中，所述生物素标记核酸是指核酸的一个或多个核苷酸上含有生物素标记，所述生物素与碱基共价连接。
14、在一些实施方案中，所述生物素标记核酸的3'末端和/或5'末端的核苷酸上含有生物素标记。
15、在一些实施方案中，所述生物素标记核酸是生物素标记的单链dna、生物素标记的双链dna、生物素标记的rna或生物素标记的dna-rna杂合体。
16、本申请的第二本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种从链霉亲和素磁珠上洗脱生物素标记核酸的方法，所述方法包括如下步骤：
2.权利要求1所述的方法，所述甲酰胺的浓度是5-30mM，优选5-20mM。
3.权利要求1所述的方法，所述SDS的质量体积比是0.1％-10％，优选0.5％-10％。
4.权利要求1所述的方法，所述孵育是室温孵育5-30min。
5.权利要求4所述的方法，所述步骤(2)还包括在孵育后进行80-95℃热处理，优选80-95℃热处理1-10min。
6.一种蛋白质-DNA互作的片段捕获方法，所述方法包括如下步骤：
7.权利要求6所述的方法，所述含有转座酶识别核心序列和标签序列的寡核苷酸包埋在转座酶上。
8.权利要求6所述的方法，所述透化包括加入细胞透化剂，优选加入洋地黄皂苷。
9.权利要求6所述的方法，所述方法还包括纯化片段化的DNA，所述纯化采用是例如磁珠法、离心柱法或离子交换树脂法，优选磁珠法。
10.权利要求9所述的方法，所述磁珠法纯化包括将磁珠和片段化的DNA在磁珠结合缓冲液中孵育，所述磁珠结
11.权利要求10所述的方法，所述Triton X-100的体积分数是0.01-10％，优选0.01-5％；所述Tween-20的体积分数是0.01-10％，优选0.01-5％。
12.一种蛋白质-DNA互作的检测方法，所述方法包括如下步骤：
13.权利要求12所述的方法，所述qPCR扩增在包含DNA聚合酶、dNTP、引物、缓冲液以及探针和/或荧光染料的体系中进行。
14.一种蛋白质-DNA互作基因文库的构建方法，所述方法包括如下步骤：
15.权利要求14所述的方法，所述连接测序接头包括加入与标签序列匹配并带有接头序列的引物，通过PCR扩增得到带有测序接头的DNA片段。
16.一种试剂盒，所述试剂盒包括生物素化的转座酶复合物、链霉亲和素磁珠和链霉亲和素磁珠洗脱液，所述链霉亲和素洗脱液包含甲酰胺和SDS，所述生物素化的转座酶复合物包括转座酶和生物素标记的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括转座酶识别核心序列和标签序列。
17.权利要求16所述的试剂盒，所述甲酰胺的浓度是5-30mM，优选5-20mM；所述SDS的质量体积比是0.1％-10％，优选0.5％-10％。
18.权利要求17所述的试剂盒，所述试剂盒还包括磁珠结合缓冲液，所述磁珠结合缓冲液包括Triton X-100、Tween-20和PBS缓冲液。
19.权利要求18所述的试剂盒，所述TritonX-100的体积分数是0.01-10％，优选0.01-5％；所述Tween-20的体积分数是0.01-10％，优选0.01-5％。
...【技术特征摘要】
1.一种从链霉亲和素磁珠上洗脱生物素标记核酸的方法，所述方法包括如下步骤：
2.权利要求1所述的方法，所述甲酰胺的浓度是5-30mm，优选5-20mm。
3.权利要求1所述的方法，所述sds的质量体积比是0.1％-10％，优选0.5％-10％。
4.权利要求1所述的方法，所述孵育是室温孵育5-30min。
5.权利要求4所述的方法，所述步骤(2)还包括在孵育后进行80-95℃热处理，优选80-95℃热处理1-10min。
6.一种蛋白质-dna互作的片段捕获方法，所述方法包括如下步骤：
7.权利要求6所述的方法，所述含有转座酶识别核心序列和标签序列的寡核苷酸包埋在转座酶上。
8.权利要求6所述的方法，所述透化包括加入细胞透化剂，优选加入洋地黄皂苷。
9.权利要求6所述的方法，所述方法还包括纯化片段化的dna，所述纯化采用是例如磁珠法、离心柱法或离子交换树脂法，优选磁珠法。
10.权利要求9所述的方法，所述磁珠法纯化包括将磁珠和片段化的dna在磁珠结合缓冲液中孵育，所述磁珠结合缓冲液包括tritonx-100、tween-20和pbs缓冲液。
11.权利要求10所述的方法，所述triton x-100的体积分数是0.01-10％，优选0.01-5％；所述tween-20的体积分数是0.01-10％...
【专利技术属性】
技术研发人员：易文洋，曹林，江明扬，聂俊伟，杨斌刚，
申请(专利权)人：南京诺唯赞生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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