【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微藻育种领域，具体为一种筛选和培育能够快速生长的黄色蛋白核小球藻突变株的方法。
技术介绍
1、近年来世界人口不断增长，有限的自然资源难以满足全球对粮食和饲料的需求。全球约57％的蛋白质供应来自植物来源(几乎全部来自陆地植物)；其余43％来自所饲养的畜禽类，随着全球温室效应愈演愈烈以及环境污染导致土地资源枯竭，传统农作物和肉制品将难以维持粮食缺口。基于环境保护、粮食需求以及健康饮食观念深入人心，树立大食物观、发展动物植物微生物并举的多元化食物供给体系迫在眉睫，也推动了新型蛋白进入食品市场。
2、小球藻作为新型绿色健康可持续食品备受关注。与传统农作物相比它生长周期短，蛋白含量在50-60％，富含多种活性物质，早在2012年被国家批准为新资源食品。同时被联合国粮食及农业组织认定为“绿色健康食品”。目前微藻市场份额也在逐年攀登，transparency market research最新发布的报告显示：在2020-2030年间，全球微藻市场预计将以约5％的年复合增长率健康增长，2030年底市值将达到32亿美元。尽管有以上优点，小球藻干粉在食品中也仅用作着色剂或营销目的添加在食品中，而不是作为食品替代传统食物。这归因于小球藻干粉多为绿色或墨绿色，掺入食品中会导致观感不佳，消费者接受度低，然而现有脱色方法树脂、活性炭吸附法，操作过程繁琐；然而有机溶剂萃取法所使用的有机溶剂容易污染环境，对污水的处理液进一步提高了成本，导致在产业中脱色成本大大提升，且处理后藻体营养物质会大量流失。目前已经开发了几种方法用于培育新型突变
3、因此有必要利用常压室温等离子体进行随机诱变处理，目的是获得一株新型叶绿素缺陷型小球藻突变体，以解决在藻粉加工中脱色问题，这对新藻种培育以及小球藻产业应用具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术的主要目的在于提供一种筛选和培育能够快速生长的黄色蛋白核小球藻的方法，该黄色蛋白核小球藻叶绿素含量显著低于野生型蛋白核小球藻，且生物量显著高于野生型，能够解决小球藻在产业化应用中脱色的技术问题，实现了新藻种培育，且相比原始藻株更加适合异养条件，更适用于工业化发酵。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种筛选和培育能够快速生长的黄色蛋白核小球藻突变株的方法，包括以下步骤：
3、第一步：藻株活化：将野生型藻株在固体培养基中划线培养后，挑取单藻落在黑暗条件下进行摇瓶培养，培养至对数生长期进行多次传代以保持其细胞活性；
4、第二步：将对数生长期藻株用甘油稀释后，利用常压室温等离子体诱变仪(artp)进行诱变处理，将处理后藻悬液涂布到固体培养基中；
5、第三步：以颜色作为筛选目标，用无菌牙签将黄色突变体挑取到新鲜固体培养基中多次传代至颜色表型稳定，将黄色突变体划线后，挑取单个藻落至摇瓶中进行暗培养，获得纯化后的黄色蛋白核小球藻突变株；
6、第四步：将黄色突变藻株接种到不同葡萄糖浓度(5-50g/l)的液体培养基中，25～30℃，摇床140rpm暗培养4～6天；
7、第五步：收集藻液，离心洗涤干燥，测定生物量和葡萄糖消耗量，筛选得到最适碳源浓度；
8、第六步：在最适碳源浓度下培养黄色蛋白核小球藻，每天取样测定生物量，确定其生长曲线以及色素含量。
9、进一步的，所使用的培养基为bg-11基础培养基，在bg-11培养基中添加10g/l葡萄糖作为碳源对野生型蛋白核小球藻进行异养，培养至对数生长期。
10、进一步的，所述第二步具体操作如下：将处于对数生长期的野生型蛋白核小球藻用10％甘油等体积稀释至od680在0.6～0.8之间，得到藻悬液，吸取10ul藻悬液均匀涂附在无菌载片中，置于常压室温等离子体诱变仪(artp)中处理，将artp处理后的载片置于装有1ml90％的生理盐水中，将各处理组藻液均匀涂布到含有10g/l葡萄糖的bg-11的新鲜固体培养基中在28℃条件下异养。
11、进一步的，第一步的蛋白核小球藻为野生型w，第三步中筛选得到的黄色蛋白核小球藻定义为突变体a19。
12、进一步的，第四步中向培养基中加入5g/l、10g/l、20g/l、30g/l、40g/l的葡萄糖进行异养。
13、进一步的，第五步具体操作如下：生物量测定：取藻液至已称重的离心管中进行离心，洗涤后重新离心2-3次后将藻体沉淀置于60℃真空干燥箱中烘干12h至恒重，称重后确定生物量；
14、葡萄糖残留：取离心后上清液1ml加入比色管中，加入dns试剂2ml，煮沸2min，冷却后用纯水稀释至15ml刻度，测定490nm吸光值。
15、进一步的，叶绿素含量测定方法：收集培养藻液，离心后用ddh2o洗涤，重复离心2次，收集藻沉淀冻干得到藻粉，称取一定量的冻干藻粉，在液氮保护下充分研磨，甲醇萃取后，在4℃黑暗条件下萃取至藻渣变为白色，收集上清液，操作全程在避光条件下进行，分光光度计测定665.2nm、652.4nm和470nm下吸光值。
16、进一步的，获得和检测叶黄素的方法：称取冻干后的藻粉，低温研磨后加入无水乙醇震荡提取，离心收集上清，沉淀中重新加入无水乙醇震荡提取，直至藻粉呈现白色，收集提取液，对提取液进行离心，取上清液氮气吹干，再加入无水乙醇溶解色素，过膜后高效液相色谱仪分析，整个过程避光条件下进行。
17、进一步的，黄色蛋白核小球藻须在含有5g/l葡萄糖的bg-11培养基中，在黑暗条件下培养4天。
18、本专利技术至少具备以下有益效果：
19、1、本专利技术以野生型蛋白核小球藻为出发藻株，利用常压室温等离子体诱变仪处理，经过颜色筛选获得黄色的叶绿素缺陷型蛋白核小球藻a19。该突变体细胞颜色呈现黄色，且颜色性状稳定。异养条件下叶绿素含量显著低于野生型，但生长速率快，生物量比野生型要高，且多次传代接种其颜色、叶绿素含量以及生物量没有发生显著变化。该突变株的成功培育不仅解决了藻粉生产应用中脱色的技术难题，同时拓宽了小球藻应用市场，降低了异养获得高密度生物质的成本，同时其他微藻藻种也可使用该方法进行藻种突变，为实验室培育新藻种提供了新的方向；
20、2、专利技术主要包括野生型蛋白核小球藻纯化和活化培养、常压室温等离子体诱变处理藻细胞、蛋白核小球藻颜色突变株筛选与纯化培养、最适碳源优化及生物量和叶绿素检测等工艺步骤，获得的蛋白核小球藻突变株更具有生产和应用价值，其次相比于传统小球藻干粉脱色后应用于食品加工，更加安全高效。
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1.一种筛选和培育能够快速生长的黄色蛋白核小球藻突变株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种筛选和培育能够快速生长的黄色蛋白核小球藻突变株的方法，其特征在于：所使用的培养基为BG-11基础培养基，在BG-11培养基中添加10g/L葡萄糖作为碳源对野生型蛋白核小球藻进行异养，培养至对数生长期。
3.根据权利要求2所述的一种筛选和培育能够快速生长的黄色蛋白核小球藻突变株的方法，其特征在于：所述第二步具体操作如下：将处于对数生长期的野生型蛋白核小球藻用10％甘油等体积稀释至OD680在0.6～0.8之间，得到藻悬液，吸取10uL藻悬液均匀涂附在无菌载片中，置于常压室温等离子体诱变仪(ARTP)中处理，将ARTP处理后的载片置于装有1mL90％的生理盐水中，将各处理组藻液均匀涂布到含有10g/L葡萄糖的BG-11的新鲜固体培养基中在28℃条件下异养。
4.根据权利要求2所述的一种筛选和培育能够快速生长的黄色蛋白核小球藻突变株的方法，其特征在于：第一步的蛋白核小球藻为野生型W，第三步中筛选得到的黄色蛋白核小球藻定义为突变体A19
5.根据权利要求1所述的一种筛选和培育能够快速生长的黄色蛋白核小球藻突变株的方法，其特征在于：第四步中向培养基中加入5g/L、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L的葡萄糖进行异养。
6.根据权利要求5所述的一种筛选和培育能够快速生长的黄色蛋白核小球藻突变株的方法，其特征在于：第五步具体操作如下：生物量测定：取藻液至已称重的离心管中进行离心，洗涤后重新离心2-3次后将藻体沉淀置于60℃真空干燥箱中烘干12h至恒重，称重后确定生物量；
7.根据权利要求6所述的一种筛选和培育能够快速生长的黄色蛋白核小球藻突变株的方法，其特征在于：
8.根据权利要求5所述的一种筛选和培育能够快速生长的黄色蛋白核小球藻突变株的方法，其特征在于：获得和检测叶黄素的方法：称取冻干后的藻粉，低温研磨后加入无水乙醇震荡提取，离心收集上清，沉淀中重新加入无水乙醇震荡提取，直至藻粉呈现白色，收集提取液，对提取液进行离心，取上清液氮气吹干，再加入无水乙醇溶解色素，过膜后高效液相色谱仪分析，整个过程避光条件下进行。
9.根据权利要求8所述的一种筛选和培育能够快速生长的黄色蛋白核小球藻突变株的方法，其特征在于：黄色蛋白核小球藻须在含有5g/L葡萄糖的BG-11培养基中，在黑暗条件下培养4天。
...【技术特征摘要】
1.一种筛选和培育能够快速生长的黄色蛋白核小球藻突变株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种筛选和培育能够快速生长的黄色蛋白核小球藻突变株的方法，其特征在于：所使用的培养基为bg-11基础培养基，在bg-11培养基中添加10g/l葡萄糖作为碳源对野生型蛋白核小球藻进行异养，培养至对数生长期。
3.根据权利要求2所述的一种筛选和培育能够快速生长的黄色蛋白核小球藻突变株的方法，其特征在于：所述第二步具体操作如下：将处于对数生长期的野生型蛋白核小球藻用10％甘油等体积稀释至od680在0.6～0.8之间，得到藻悬液，吸取10ul藻悬液均匀涂附在无菌载片中，置于常压室温等离子体诱变仪(artp)中处理，将artp处理后的载片置于装有1ml90％的生理盐水中，将各处理组藻液均匀涂布到含有10g/l葡萄糖的bg-11的新鲜固体培养基中在28℃条件下异养。
4.根据权利要求2所述的一种筛选和培育能够快速生长的黄色蛋白核小球藻突变株的方法，其特征在于：第一步的蛋白核小球藻为野生型w，第三步中筛选得到的黄色蛋白核小球藻定义为突变体a19。
5.根据权利要求1所述的一种筛选和培育能够快速生长的黄色...
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