【技术实现步骤摘要】
一种基于均相生物识别反应和tdt诱导聚合信号放大的atp电化学检测方法，属于生命科学。
技术介绍
1、atp是一种细胞内的重要能量分子，广泛存在于所有生物体中，包括细菌、植物和动物。它在细胞内储存和传递能量，并在许多生物学过程中起着关键作用。atp由一个腺嘌呤碱基、一个核糖糖类和三个磷酸基团组成。它通过磷酸键的高能键释放能量，并在细胞内的各种代谢反应中提供能量。此外，atp还参与细胞信号传导、细胞运动和细胞骨架重组等生物学过程。atp的生物合成主要通过细胞内的三磷酸腺苷合成酶催化的反应来进行。这个反应将adp与无机磷酸根结合，形成atp。而atp的降解则通过细胞内的atp酶类催化的反应来进行，将atp水解为adp和无机磷酸，释放能量。atp在细胞内的能量代谢中起着重要作用。它作为一种高能物质，通过供应和转移化学能量，驱动各种细胞过程，包括细胞分裂、蛋白质合成、肌肉收缩和神经传递等。atp在多种疾病的发展中扮演着重要角色。例如，线粒体功能障碍导致的atp合成减少与一些神经退行性疾病（如帕金森病）和心血管疾病有关。此外，atp还与肿瘤的生长和转移、免疫反应和炎症等疾病过程密切相关。目前，国内外关于atp的检测方法主要有：生物发光法、高效液相色谱法、比色法、荧光法等，这些方法各有优缺点。因而进一步研究一种灵敏度高、易于操作、选择性高的新方法显得尤为重要。
2、核酸适配体是通过指数配体富集进化技术（selex）筛选得到的对特定物质（小分子化合物、蛋白质、细胞、离子等）具有高度亲和性的一段单链dna或者rna。相对于免疫识别检
3、与此同时，为了提高检测性能，各种信号放大技术，如杂交链式反应、滚环扩增反应、纳米材料、聚合反应等被应用于生物传感领域。其中，tdt诱导聚合（tdt-mediated dutpnick-end labeling，简称tunel）具有高灵敏度、适用广泛、可与其他技术相结合等优点，自被提出以来在各大领域得到了大量应用，其在生物传感中的应用也得到科研工作者的青睐。
技术实现思路
1、针对现存技术不足，本专利技术目的是提供一种基于均相生物识别反应和tdt诱导聚合信号放大的atp电化学检测方法，具有高效、快速、高灵敏度等特点。
2、为了实现上述目的，本专利技术的技术方案：
3、一种基于均相生物识别反应和tdt诱导聚合信号放大的atp电化学检测方法，包括以下步骤：
4、（1）hp的制备
5、使用前，所有寡核苷酸溶液先在95°c加热5 min，然后s2逐渐冷却至室温，s1、s3和s4立即冷却至室温。接下来，将500 μl 2.0 μm s1与500 μl 2.0 μm s2混合，室温下在摇床上混匀反应60 min，形成s1-s2 dna溶液。之后，20 μl 20 nm检测目标小分子，5 μl 4 u μl-1 exo i和5 μl 20 mm ph 7.4 tris-hcl缓冲液加入到20 μl s1-s2 dna溶液中，然后在37℃下混匀反应120 min。最后，将合成的混合物加热到80℃，反应15 min（灭活exo і）。
6、（2）玻碳电极的预处理
7、依次用800目、2000目和5000目砂纸对玻碳电极表面进行打磨，以1.0 μm，0.3 μm氧化铝悬浮液抛光玻碳电极成镜面，用双蒸水彻底冲洗；随后在无水乙醇和超净水中分别超声清洗9 min后，将电极置于0.5 m硫酸溶液中进行循环伏安扫描30个循环以去除电极表面的杂质，设置的扫描电位为-0.3 v至+1.50 v，以0.5 v·s-1的扫速进行扫描，直至获得稳定的循环伏安图，玻碳电极表面用蒸馏水冲洗并干燥。将2 mg ml-1的氯金酸溶于0.5 m的硫酸溶液中，将玻碳电极表面浸泡在氯金酸溶液中进行电化学沉积，电化学沉积施加电位为-200 mv，时间为350 s，洗净并吹干。
8、（3）金电极的修饰
9、将10 μl 2 μm s3溶液滴在预先清洗的金电极表面，在37℃环境下孵育60 min；用10 mm ph=7.4的tris-hcl缓冲液冲洗后，将10 μl 1.0 mm mch溶液涂抹于电极上，37℃环境下60 min；再次用10 mm ph=7.4的tris-hcl缓冲液冲洗电极，以去除多余的物理吸附的试剂。
10、（4）dna杂交反应
11、将上述（3）合成的电极浸入50 μl由25 μl 0.5 μm s4和25 μl hp溶液组成的混合物中；在37℃下进行120 min的自组装反应，然后用ph=7.4的tris-hcl缓冲液仔细洗涤，电极表面将形成一层dna纳米结构。
12、（5）聚合反应
13、将10 μl含有dntp和5 u ml-1tdt的混合物滴在上述（4）的传感电极上，再孵育60min。
14、（6）电化学测定
15、将进行上述（5）后所得的金电极放入含5 μm ru(nh3)63+的tris-hcl缓冲液中5min用差分脉冲伏安法（dpv）在-0.15 v至-0.4 v的电位之间进行扫描（参数设置如下：采样间隔，0.0167 s；脉冲宽度，0.05 s；振幅，0.05 v）从而测量电化学信号。
16、本方法设计并基于均相生物识别反应和tdt诱导聚合信号放大的原理对atp进行检测，避免了目前常用信号策略中纳米材料和生物酶(易受外界环境如ph和温度影响)的使用，在六氨合钌在作用下信号得到成倍的放大，灵敏度极大提高建立了一种简单、灵敏的检测atp的方法，为今后的监管提供了方便。
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1.一种基于均相生物识别反应和TDT诱导聚合信号放大的ATP电化学检测方法，属于生命科学技术领域。其检测原理为：将一种由ATP适配体和3’末端暴露的发夹DNA组成的DNA复合物，用于在外切酶I(Exo I)存在的情况下与ATP进行均相反应，从而产生末端钝的发夹DNA HP。将巯基化的核酸探针S3固定在预处理后的玻碳电极表面，得到核酸探针S3修饰的金电极。HP被引入S3电极后，在生物素化核酸探针S4的参与下，DNA杂交反应将导致设计的DNA纳米结构的自组装形成。该自组装结构具有三个自由3’端的y型DNA结构，会进一步在dNTP池中激活TdT诱导的聚合反应，生成大量的长单链DNA产物，大量的Ru(NH3)63+可以通过强静电相互作用吸附到带负电荷的DNA磷酸主链上。因此，可以获得显著放大的电化学信号，用于目标的敏感监测。本专利技术方法提供了一种对ATP有简单、快捷、灵敏的检测方法，具有良好的实用价值，便于推广。
2.根据权利要求1所述的一种基于均相生物识别反应和TDT诱导聚合信号放大的ATP电化学检测方法，其中HP制备的步骤如下：使用前，所有寡核苷酸溶液先在95°C加热5
3.根据权利要求1所述的一种基于均相生物识别反应和TDT诱导聚合信号放大的ATP电化学检测方法，其中玻碳电极预处理的步骤如下：依次用800目、2000目和5000目砂纸对玻碳电极表面进行打磨，以1.0 μm，0.3 μm氧化铝悬浮液抛光玻碳电极成镜面，用双蒸水彻底冲洗；随后在无水乙醇和超净水中分别超声清洗9 min后，将电极置于0.5 M硫酸溶液中进行循环伏安扫描30个循环以去除电极表面的杂质，设置的扫描电位为-0.3 V至+1.50 V，以0.5 V·s-1的扫速进行扫描，直至获得稳定的循环伏安图，玻碳电极表面用蒸馏水冲洗并干燥。将2 mg mL-1的氯金酸溶于0.5 M的硫酸溶液中，将玻碳电极表面浸泡在氯金酸溶液中进行电化学沉积，电化学沉积施加电位为-200 mV，时间为350 s，洗净并吹干。
4.根据权利要求1所述的一种基于均相生物识别反应和TDT诱导聚合信号放大的ATP电化学检测方法，其中金电极修饰的步骤如下：将10 μL 2 μM S3溶液滴在预先清洗的金电极表面，在37℃环境下孵育60 min；用10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲液冲洗后，将10 μL 1.0mM MCH溶液涂抹于电极上，37℃环境下60 min；再次用10 mM pH=7.4的Tris-HCl缓冲液冲洗电极，以去除多余的物理吸附的试剂。
5.根据权利要求1所述的一种基于均相生物识别反应和TDT诱导聚合信号放大的ATP电化学检测方法，其中进行DNA杂交反应的步骤如下：将权利要求4的电极浸入50 μL由25 μL0.5 μM S4和25 μL HP溶液组成的混合物中；在37℃下进行120 min的自组装反应，然后用pH=7.4的Tris-HCl缓冲液仔细洗涤，电极表面将形成一层DNA纳米结构。
6.根据权利要求1所述的一种基于均相生物识别反应和TDT诱导聚合信号放大的ATP电化学检测方法，其中进行聚合反应的步骤如下：将10 μL含有dNTP和5 U mL-1 TdT的混合物滴在权利要求5后的传感电极上，再孵育60 min。
7.根据权利要求1所述的一种基于均相生物识别反应和TDT诱导聚合信号放大的ATP电化学检测方法，其中电化学测定的步骤如下：将进行权利要求6后所得的金电极放入含5 μMRu(NH3)63+的Tris-HCl缓冲液中5 min用差分脉冲伏安法（DPV）在-0.15 V至-0.4 V的电位之间进行扫描（参数设置如下：采样间隔，0.0167 s；脉冲宽度，0.05 s；振幅，0.05 V）从而测量电化学信号。
...【技术特征摘要】
1.一种基于均相生物识别反应和tdt诱导聚合信号放大的atp电化学检测方法，属于生命科学技术领域。其检测原理为：将一种由atp适配体和3’末端暴露的发夹dna组成的dna复合物，用于在外切酶i(exo i)存在的情况下与atp进行均相反应，从而产生末端钝的发夹dna hp。将巯基化的核酸探针s3固定在预处理后的玻碳电极表面，得到核酸探针s3修饰的金电极。hp被引入s3电极后，在生物素化核酸探针s4的参与下，dna杂交反应将导致设计的dna纳米结构的自组装形成。该自组装结构具有三个自由3’端的y型dna结构，会进一步在dntp池中激活tdt诱导的聚合反应，生成大量的长单链dna产物，大量的ru(nh3)63+可以通过强静电相互作用吸附到带负电荷的dna磷酸主链上。因此，可以获得显著放大的电化学信号，用于目标的敏感监测。本发明方法提供了一种对atp有简单、快捷、灵敏的检测方法，具有良好的实用价值，便于推广。
2.根据权利要求1所述的一种基于均相生物识别反应和tdt诱导聚合信号放大的atp电化学检测方法，其中hp制备的步骤如下：使用前，所有寡核苷酸溶液先在95°c加热5 min（冻融），然后s2逐渐冷却至室温，s1、s3和s4立即冷却至室温。接下来，将500 μl 2.0 μm s1与500 μl 2.0 μm s2混合，室温下在摇床上混匀反应60 min，形成s1-s2 dna溶液。之后，20 μl 20 nm检测目标小分子，5 μl 4 u μl-1 exo i和5 μl 20 mm ph 7.4 tris-hcl缓冲液加入到20 μl s1-s2 dna溶液中，然后在37℃下混匀反应120 min。最后，将合成的混合物加热到80℃，反应15 min（灭活exo і）。
3.根据权利要求1所述的一种基于均相生物识别反应和tdt诱导聚合信号放大的atp电化学检测方法，其中玻碳电极预处理的步骤如下：依次用800目、2000目和5000目砂纸对玻碳电极表面进行打磨，以1.0 μm，0.3 μm氧化铝悬浮液抛光玻碳电极成镜面，用双蒸水彻底冲洗；随后在无水乙醇和超净水中分别超声清洗9 min后，将电极置于0.5 m...
【专利技术属性】
技术研发人员：许媛媛，杨健，李嘉华，
申请(专利权)人：南京农业大学三亚研究院，
类型：发明
国别省市：
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