【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及rna结合蛋白质(rbp)分析，具体为同时鉴定rbp靶标和提供转录组信息的测序方法及应用。
技术介绍
1、rna水平的基因表达调控是许多生物过程的基础，它复杂而精密地准确控制rna分子的生命周期。这类转录后调控主要是由细胞内部分蛋白质与rna以复杂的方式相互作用，组装形成动态的核糖核蛋白颗粒(ribonucleoprotein particles，rnps)以共同协调细胞命运、适应环境变化等一系列过程。rna结合蛋白(rna-binding proteins，rbps)可以完整的参与rna转录后的不同生物阶段，并与rrna、trna等组成分子机器，在基因表达调控网络中扮演着枢纽的角色。然而许多rbp的功能与分子机制仍然是空白，导致rbp在发育以及疾病中的作用的研究进展缓慢。如今，越来越多的研究表明许多人类疾病，包括神经系统疾病、代谢性疾病以及癌症，都与rbp功能障碍相关。目前鉴定到与疾病相关的rbp数量已经超过1000例，但是除了少数例外，人们极缺乏对rbp生理调控系统及病理性机制的理解。当疾病表型不能用rbp所熟知功能解释时，找到它特异性识别哪些靶标，以rbp为核心检测致病突变引发的相互作用发生异常，对于理解疾病发生过程至关重要。
2、目前研究rbp与rna的结合的前沿技术可以分为两大类：第一种是依赖交联与抗体的免疫沉淀方法；第二种是依赖rna加工酶的原位检测方法。
3、rna免疫沉淀(rip)和交联免疫沉淀(clip)是研究细胞内rna-蛋白质相互作用最基础的技术，它们使用特定抗体来沉淀
4、最近，基于rna编辑的tribe和stamp被开发出来，这类方法利用异位表达的rbp-脱氨酶融合蛋白来标记rna底物。rna脱氨主要由两类酶介导：作用于rna的腺苷脱氨酶(adars)和载脂蛋白b mrna编辑酶胞嘧啶脱氨酶家族(也称为aid/apobec家族)，分别负责a-to-i和c-to-u的编辑。adar结构是模块化的，由双链rna结合基序(dsrbms)和催化脱氨结构域(adarcd)组成，均可以独立工作。adarcd将rna上的腺苷脱氨基为肌苷，被逆转录酶识别为鸟苷，因此通过rna测序可以确定a-g突变来识别adar编辑。内源adar编辑位点通常在非编码区域alu重复元件中，因为它们偏向形成双链rna特征。apobec1的rna结合能力微弱，在没有伴侣蛋白apobec1偶联因子(acf)存在的情况下无法编辑其底物，其编辑可能依赖c末端介导的同源二聚化。细胞内aopbec1编辑均存在结构和序列偏好性，几乎都发生在3′utrs，偏向与au丰富的区域结合，序列上更偏好编辑5′-ac-3′。这些编辑酶的方法避免了靶标富集步骤，保留完整的转录组信息。虽然这些不需ip的技术允许从低投入材料(包括单细胞)中发现底物，但单个酶的使用可能造成假阴性结果，同时它们对基因操作的依赖限制了它们在原代细胞和临床样本中的应用。此外，异位表达的融合蛋白可能引入人为因素或干扰内源性蛋白的功能。最后，缺乏时间分辨率严重限制了它们研究动态生物过程的能力。
5、因此，为了充分理解rbp功能在不同环境下的调控作用，本领域迫切需要一种灵敏、通用且方便，能够进行双组学共同分析，具有高时间分辨率，仅需少量样本输入，并能应用于组织样本的技术。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供了融合蛋白及其应用方法，可以同时鉴定rbp靶标和提供转录组信息，解决了现有技术中存在的问题。
2、在本专利技术的一个方面，提供了一种融合蛋白，该融合蛋白包括抗体结合结构域和rna编辑结构域，所述抗体结合结构域为pag结构域，包括protein a和protein g的功能结构域，所述rna编辑结构域包括大鼠apobec1酶脱氨结构域和/或人adar2酶脱氨结构域。
3、在本专利技术的一个具体实施方案中，所述融合蛋白包括所述pag结构域，和大鼠apobec1酶脱氨结构域和人adar2酶脱氨结构域。
4、在本专利技术的另一方面提供了使用本专利技术公开的融合蛋白同时鉴定rbp靶标和提供转录组信息的应用方法，所述方法包括以下步骤：
5、1.融合蛋白的表达纯化：采用杆状病毒表达载体系统进行表达和纯化本专利技术的融合蛋白；
6、2.细胞/组织切片固定：利用甲醛溶液或3,3'-二硫代二丙酸二(n-羟基琥珀酰亚胺酯)(dsp)固定细胞/组织样品；
7、3.细胞结合cona磁珠：用dpbs重悬固定后的细胞，加入cona磁珠，室温旋转孵育，结合完磁珠的细胞转移至pcr管中；
8、4.抗体孵育：配制抗体孵育缓冲液，在实验组和对照组中分别加入rbp抗体或igg的抗体缓冲液，重悬细胞，使用涡旋振荡轻轻混匀，洗涤细胞后重悬；
9、5.脱氨酶的结合：提前配制含有本专利技术的融合蛋白的缓冲液，将步骤四中获得的孵育完二抗的细胞洗涤重悬于含有融合蛋白的缓冲液中；
10、6.编辑反应启动与终止：配制脱氨反应缓冲液，其中含有锌离子用于启动脱氨反应，将与本专利技术的融合蛋白共孵育的细胞洗涤后重悬于反应缓冲液中，以进行编辑反应；
11、7.rna提取与测序文库构建：提取细胞总rna，进行建库，检测文库浓度后，将库中的cdna进行测序；
12、8.生物信息学分析：所述生物信息学分析包括数据质控、两轮唯一比对、微调比对、鉴定单核苷酸变异(snvs)和差异编辑分析。
13、在本专利技术的一个实施方案中，在上述的步骤2中使用3,3'-二硫代二丙酸二(n-羟基琥珀酰亚胺酯)(dsp)来固定细胞。
14、在本专利技术的一个实施方案中，提供了本专利技术的融合蛋白用于鉴定rbp靶标和提供转录组信息的用途，其特征在于：其应用于组织样本、冷冻切片或单细胞样本中。
15、有益效果
16、本专利技术提供了同时鉴定rbp靶标和提供转录组信息的测序方法及应用。
17、与现有技术相比具备以下有益效果：
18、1、本专利技术公开的融合蛋白及其应用方法可以同时鉴定rbp靶标和提供转录组信息，利用本专利技术公开的技术方案，本专利技术人在hela细胞中成功鉴定了ythdf2和g3bp1等rbp的rna靶标，在hek293t细胞中检测了ptbp1和g3bp1结合的转录本与结合基序，将本专利技术技术方案所得的内源蛋白结果与金标准clip-seq比较，结果充分验证了本专利技术技术方案的实用性和灵敏性。...
【技术保护点】
1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括抗体结合结构域和RNA编辑结构域，所述抗体结合结构域为pAG结构域，包括Protein A和Protein G的功能结构域，所述RNA编辑结构域包括大鼠APOBEC1酶脱氨结构域和/或人ADAR2酶脱氨结构域。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，所述融合蛋白包括所述pAG结构域，和大鼠APOBEC1酶脱氨结构域和人ADAR2酶脱氨结构域。
3.一种使用权利要求1的融合蛋白同时鉴定RBP靶标和提供转录组信息的方法，所述方法包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于在所述步骤2)中使用3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基琥珀酰亚胺酯)来固定细胞。
5.权利要求1所述的融合蛋白用于鉴定RBP靶标和提供转录组信息的用途，其特征在于：其应用于组织样本、冷冻切片或单细胞样本中。
【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括抗体结合结构域和rna编辑结构域，所述抗体结合结构域为pag结构域，包括protein a和protein g的功能结构域，所述rna编辑结构域包括大鼠apobec1酶脱氨结构域和/或人adar2酶脱氨结构域。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，所述融合蛋白包括所述pag结构域，和大鼠apobec1酶脱氨结构域和人adar2酶脱氨结构域...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪阳明，程玘轩，谢岗，张翔宇，肖俊宇，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：
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