【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于光学显微成像，具体涉及一种同时激发/采集双光子、三光子信号的显微成像系统及显微镜。
技术介绍
1、双光子显微成像技术具有光学切片能力、生化信息灵敏度高、空间分辨率高、对生物组织杀伤性低等优点，是对活体组织和细胞进行非侵入性、高分辨率成像的重要手段，也是生物工程领域重要的研究工具。现有的双光子显微成像系统主要采集生物组织的双光子激发荧光和二次谐波，其中双光子激发荧光的主要来源是含有外源或内源荧光的生物分子，二次谐波的主要来源是含有胶原蛋白的成分。三光子显微成像技术由于使用的激发光波长更长，在生物组织中穿透更深，是脑科学的重要研究工具。三光子显微成像系统采集的三光子激发荧光信号来源于含有外源或内源荧光的生物分子，可以对水性介质和脂质、矿化结构之间的界面进行特异性成像。同时对双光子信号和三光子信号进行显微成像，可以获得更加全面的组织生化信息。
2、然而，双光子显微成像和三光子显微成像需要由不同波长范围的飞秒脉冲激发，对激光的产生和传输提出新要求。一类现有技术基于显微镜平台，并采用两个激光源分别激发双光子和三光子信号，极大提高激光器成本。另一类现有技术虽然只使用单一激光源进行双光子和三光子成像，但要适用于三光子成像，所以激光波长较长，则需要对生物组织染色才能激发出双光子激发荧光信号，无法直接对无标记的生物组织成像。
3、因此，这里需提出一种能够同时激发/采集无标记（不染色）生物组织内源性双光子和三光子信号的显微成像系统，以便在实际的临床应用中快速进行活体组织的无创检查。
1、为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种同时激发/采集双光子、三光子信号的显微成像系统，该系统基于单一波长激光器获得双波长激发源，能同时激发/采集无标记生物组织的双光子激发荧光、二次谐波信号和三次谐波信号。
2、为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
3、本专利技术的第一目的是公开一种同时激发/采集双光子、三光子信号的显微成像系统，包括：激光器、显微成像装置及信号采集/分离装置；显微成像装置与激光器之间通过光纤连接，显微成像装置与信号采集/分离装置之间通过光纤连接；
4、显微成像装置内依次设有相位延迟片、倍频模块、反射器、分光器和微型物镜；相位延迟片用于调节激光器发出的激光的相位，以获得具有预定偏振方向的激光，倍频模块用于对具有预定偏振方向的激光进行频率倍增，产生波长为激光器发出的激光的波长的一半的短波长激发脉冲；其中相位延迟片包括依次设置的四分之一波片和半波片；显微成像装置内还设有调光装置。
5、信号采集/分离装置，用于接收所述显微成像装置出射的光信号并进行多维光子计数测量，将光信号转换为电信号输出，以得到同时具有双光子荧光信号、二次谐波信号和三次谐波信号的多衬度生物图像。
6、优选地，倍频模块包括第一汇聚透镜、非线性介质和第二准直透镜；非线性介质设置于第一汇聚透镜和第二准直透镜之间；第一汇聚透镜的后焦平面与所述第二准直透镜的前焦面重合，非线性介质位于第一汇聚透镜的后焦平面上。
7、优选地，非线性介质的材质为铌酸锂晶体或磷酸钛氧钾晶体。
8、优选地，反射器为扫描振镜，分光器为二向色滤波片。
9、优选地，激光器与显微成像装置由自带光纤准直器的单模光纤连接，所述单模光纤自带的光纤准直器包含单模光纤的尾纤和第一准直透镜，相位延迟片位于第一准直透镜的出射光路上；分光器位于反射器的反射光路上；微型物镜位于分光器的透射光路或反射器的反射光路上。
10、优选地，调光装置为设置于反射器和分光器之间的第二汇聚透镜、位于微型物镜和分光器之间的第二准直透镜以及位于分光器反射光路上的第三汇聚透镜；第二汇聚透镜的后焦点、第二准直透镜在反射器反射光路上的前焦点与第三汇聚透镜在分光器反射光路上的前焦点三个焦点重合；第二汇聚透镜的后焦点位于分光器；第三汇聚透镜通过多模光纤与所述信号采集/分离装置连接。
11、优选地，信号采集/分离装置具有并行的信号探测模块，包括二次谐波信号探测模块、双光子荧光信号探测模块、三次谐波信号探测模块和双光子荧光信号补充探测模块；
12、并行的每一信号探测模块具有分光装置和光电信号转换装置；分光装置将二次谐波信号、双光子荧光信号、三次谐波信号和双光子补充荧光信号分别送入相应探测模块；光电信号转换装置分别对相应探测模块的分光信号进行转化，得到电信号；
13、信号采集/分离装置还包括数据采集卡，通过算法程序对电信号进行分析，以得到同时具有双光子荧光信号、二次谐波信号和三次谐波信号的多衬度生物图像。
14、优选地，信号采集/分离装置具有第三准直透镜，第三准直透镜通过多模光纤与显微成像模块连接，在第三准直透镜的透射光路上依次设置第二二向色滤波片、第三二向色滤波片、第四二向色滤波片和第五带通滤波片；
15、第二二向色滤波片的反射光路上设有第二带通滤波片、第一光电倍增管和第一光子计数器；第三二向色滤波片的反射光路上设有第三带通滤波片、第二光电倍增管和第二光子计数器；第四二向色滤波片的反射光路上设有第四带通滤波片、第三光电倍增管和第三光子计数器；第四二向色滤波片的透射光路上设有第五带通滤波片、第四光电倍增管和第四光子计数器。
16、优选地，第二二向色滤波片与第三准直透镜之间的光路上还设有第一带通滤波器。
17、优选地，激光器为掺饵光纤激光器。
18、本专利技术的第二目的是提供一种显微镜，该显微镜的显微成像装置的位置相对于显微镜的其他装置的位置为不特定，能直接应用于无标记待检物表面的直接测量，不需要从待检物上分离样品也不需要对待检物进行任何的染色。
19、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
20、本专利技术公开的同时激发/采集双光子、三光子信号的显微成像系统，经倍频装置二倍频后产生的二倍频光和剩余基频光可以同时激发双光子信号和三光子信号，其中由倍频晶体倍频后的波长为775 nm的二倍频光激发双光子信号（生物组织本征的双光子激发荧光、二次谐波），波长为1550 nm的基频光激发三光子信号（三次谐波），从而实现单一激光器系统同时激发无标记生物组织双光子信号（双光子激发荧光和二次谐波信号）和三光子信号（三次谐波信号），使整个显微镜系统紧凑、成本低。
21、本专利技术公开的同时激发/采集双光子、三光子信号的显微成像系统同一个信号采集/分离光路可以同时采集无标记生物组织的双光子信号（双光子激发荧光、二次谐波）和三光子信号（三次谐波），最大限度减少成像时间、减少激光对生物组织的损伤。此系统中，不同信号的采集模块由数据采集卡和电脑进行同步控制，可实现同时激发/采集无标记生物组织的双光子信号和三光子信号，可实现光刺激、点扫描成像和线扫描成像的融合及同步，能够在介观尺度、以亚细胞分辨率对细胞进行光遗传调控，同时可对生物组织的结构和功能信息进行量化观测。
22、进一步地，基于本本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种同时激发/采集双光子、三光子信号的显微成像系统，其特征在于，包括激光器、显微成像装置及信号采集/分离装置；显微成像装置与激光器之间通过光纤连接，显微成像装置与信号采集/分离装置之间通过光纤连接；
2.根据权利要求1所述的同时激发/采集双光子、三光子信号的显微成像系统，其特征在于，所述倍频模块包括第一汇聚透镜（6）、非线性介质（7）和第二准直透镜（8）；所述第一汇聚透镜（6）的后焦平面与所述第二准直透镜（8）的前焦面重合，所述非线性介质（7）位于第一汇聚透镜的后焦平面上。
3.根据权利要求2所述的同时激发/采集双光子、三光子信号的显微成像系统，其特征在于，所述非线性介质（7）的材质为铌酸锂晶体或磷酸钛氧钾晶体。
4.根据权利要求1所述的同时激发/采集双光子、三光子信号的显微成像系统，其特征在于，所述激光器与所述显微成像装置由自带光纤准直器的单模光纤（2）连接，所述单模光纤自带的光纤准直器包含单模光纤的尾纤和第一准直透镜（3），所述相位延迟片位于第一准直透镜（3）的出射光路上；
5.根据权利要求4所述的同时激发/采集双光子、三光
6.根据权利要求1所述的同时激发/采集双光子、三光子信号的显微成像系统，其特征在于，所述信号采集/分离装置具有并行的多维信号探测模块，包括二次谐波信号探测模块、双光子荧光信号探测模块、三次谐波信号探测模块和双光子荧光信号补充探测模块；
7.根据权利要求1所述的同时激发/采集双光子、三光子信号的显微成像系统，其特征在于，所述信号采集/分离装置具有第三准直透镜（16），第三准直透镜（16）通过多模光纤（15）与显微成像模块连接，在第三准直透镜（16）的透射光路上依次设置第二二向色滤波片（18）、第三二向色滤波片（22）、第四二向色滤波片（26）和第五带通滤波片（30）；
8.根据权利要求7所述的同时激发/采集双光子、三光子信号的显微成像系统，其特征在于，所述第二二向色滤波片（18）与第三准直透镜（16）之间的光路上还设有第一带通滤波器（17）。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的同时激发/采集双光子、三光子信号的显微成像系统，其特征在于，所述激光器（1）为掺饵光纤激光器。
10.基于权利要求1-9任意一项所述的同时激发/采集双光子、三光子信号的显微成像系统的显微镜，其特征在于，所述显微成像装置的位置相对显微镜其他装置的位置为不特定。
...【技术特征摘要】
1.一种同时激发/采集双光子、三光子信号的显微成像系统，其特征在于，包括激光器、显微成像装置及信号采集/分离装置；显微成像装置与激光器之间通过光纤连接，显微成像装置与信号采集/分离装置之间通过光纤连接；
2.根据权利要求1所述的同时激发/采集双光子、三光子信号的显微成像系统，其特征在于，所述倍频模块包括第一汇聚透镜（6）、非线性介质（7）和第二准直透镜（8）；所述第一汇聚透镜（6）的后焦平面与所述第二准直透镜（8）的前焦面重合，所述非线性介质（7）位于第一汇聚透镜的后焦平面上。
3.根据权利要求2所述的同时激发/采集双光子、三光子信号的显微成像系统，其特征在于，所述非线性介质（7）的材质为铌酸锂晶体或磷酸钛氧钾晶体。
4.根据权利要求1所述的同时激发/采集双光子、三光子信号的显微成像系统，其特征在于，所述激光器与所述显微成像装置由自带光纤准直器的单模光纤（2）连接，所述单模光纤自带的光纤准直器包含单模光纤的尾纤和第一准直透镜（3），所述相位延迟片位于第一准直透镜（3）的出射光路上；
5.根据权利要求4所述的同时激发/采集双光子、三光子信号的显微成像系统，其特征在于，所述调光装置包括设置于反射器和分光器之间的第二汇聚透镜（10）、位于分光器和微型物镜（13）之间的第二准直透镜（12）以及位于分光器反射光路上的第三汇聚透镜（14）；所述第二汇聚透镜（10）的后焦点、第二准直透镜（12）在反射器反射光路上的前焦点、第三汇...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄琳，张旭春，梁建刚，张小宽，杨亚飞，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军工程大学，
类型：发明
国别省市：
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