【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种中性粒细胞外捕获网阳性细胞的制备方法及应用。
技术介绍
1、中性粒细胞是急性炎症的主要反应者之一，占人类所有循环白细胞的50％～70％，是抵御入侵病原体的初始防御。在感染过程中，中性粒细胞从外周血迁移到组织中，中性粒细胞可以在吞噬作用后迅速杀死病原体，但也可以通过释放其强大的抗菌武器库，从而最大限度地提高宿主的免疫应答，其中包括颗粒酶、活性氧以及中性粒细胞外捕获网(nets)。
2、nets是由活化的中性粒细胞分泌，由dna、组蛋白和抗菌蛋白组成的网状结构，负责捕获和杀死细胞外病原体。nets的形成过程被称为中性粒细胞外捕获网化(netosis)，这是一种重要的免疫反应，有助于防御机体免受微生物的侵害。然而，过度或不适当的netosis可能与一些疾病的发生和发展有关，包括自身免疫性疾病、感染、炎症性疾病等。因此，对细胞外捕获网化的研究有助于深入了解免疫系统的功能以及其在疾病中的作用。
3、在检测技术的实际测试工作中，为确定检测试剂的有效性，需要采用nets阳性细胞进行产品质控，现有的nets阳性细胞的制备主要通过从血液中提取中性粒细胞，并使用佛波酯(pma)刺激后培养4小时以上才能获取nets阳性细胞。整体操作时间超过6小时，并且需要专业的细胞培养设备和细胞培养环境才能进行阳性细胞的制备。
4、因此，现在急需一种能够快速、有效进行nets阳性细胞的制备方法。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术的目的在
2、为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本专利技术通过以下技术方案实现：
3、本专利技术一方面提供了一种中性粒细胞外捕获网阳性细胞的制备方法，包括如下步骤：
4、s1，取碳酸氢纳、氯化铵、乙二胺四乙酸二钠，使用纯化水溶解后，制得刺激液；所述刺激液中，碳酸氢纳的浓度为0.8～1g/l，氯化铵的浓度为8～10g/l，乙二胺四乙酸二钠的浓度为0.05～0.1g/l；
5、s2，将血液与步骤s1制得的刺激液共同孵育30～60分钟，离心后，弃上清；
6、s3，使用磷酸盐缓冲液重悬细胞，离心后，弃上清后，制得中性粒细胞外捕获网阳性细胞。
7、进一步地，步骤s1中，所述刺激液的ph为7.2～7.4。
8、进一步地，步骤s2中，血液与刺激液的体积比为(1～1.5)ml：(40～45)ml。
9、进一步地，步骤s2中，孵育过程分多次进行。
10、进一步地，步骤s2中的孵育过程优选为如下过程：
11、将血液与刺激液共同孵育5分钟，1000-2000rpm，离心5分钟，弃上清；再次使用刺激液重悬细胞，共同孵育5分钟，1000-2000rpm，离心5分钟，弃上清；第三次使用刺激液重悬细胞，共同孵育20分钟，1000-2000rpm，离心5分钟，弃上清。
12、进一步地，步骤s3中，使用磷酸盐缓冲液重悬细胞的时间为2～20min。
13、进一步地，步骤s3中，进行多次磷酸盐缓冲液重悬细胞；具体为：使用磷酸盐缓冲液重悬细胞后离心，弃上清；重复该步骤1～2次后，使用含4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲液重悬细胞，固定15分钟后，离心弃上清。
14、进一步地，中性粒细胞外捕获网阳性细胞通过以下方式保存：使用磷酸液缓冲液重悬细胞，于4～6℃保存。
15、本专利技术另一方面提供了该中性粒细胞外捕获网阳性细胞的应用，具体为：该中性粒细胞外捕获网阳性细胞可作为nets检测试剂的阳性对照品。
16、本专利技术的有益效果是：
17、本专利技术采用了一种区别于现有技术的刺激液诱导孵育血液细胞，以获得中性粒细胞外捕获网阳性细胞；本专利技术的方法无需进行细胞培养工作，无需无菌细胞操作，整体操作时间可缩短至1～1.5小时以内，相比于现有的方法，大大节省了时间，并且减少了对于操作人员的技术要求，同时减少了对仪器设备的要求。
18、本专利技术制备的中性粒细胞外捕获网阳性细胞可以作为nets检测试剂(如mpo检测试剂和/或cith3检测试剂)的阳性对照品。
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1.一种中性粒细胞外捕获网阳性细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种中性粒细胞外捕获网阳性细胞的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述刺激液的pH为7.2～7.4。
3.根据权利要求1所述的一种中性粒细胞外捕获网阳性细胞的制备方法，其特征在于，步骤S2中，血液与刺激液的体积比为(1～1.5)mL：(40～45)mL。
4.根据权利要求1所述的一种中性粒细胞外捕获网阳性细胞的制备方法，其特征在于，步骤S2中，孵育过程分多次进行。
5.根据权利要求1所述的一种中性粒细胞外捕获网阳性细胞的制备方法，其特征在于，步骤S2中的孵育过程为：
6.根据权利要求1所述的一种中性粒细胞外捕获网阳性细胞的制备方法，其特征在于，步骤S3中，使用磷酸盐缓冲液重悬细胞的时间为2～20min。
7.根据权利要求6所述的一种中性粒细胞外捕获网阳性细胞的制备方法，其特征在于，步骤S3中，进行多次磷酸盐缓冲液重悬细胞；具体为：使用磷酸盐缓冲液重悬细胞后离心，弃上清；重复该步骤1～2次后，使用含4％多聚甲醛的磷
8.根据权利要求1所述的一种中性粒细胞外捕获网阳性细胞的制备方法，其特征在于，中性粒细胞外捕获网阳性细胞通过以下方式保存：使用磷酸液缓冲液重悬细胞，于4～6℃保存。
9.权利要求1-8任一项所述的中性粒细胞外捕获网阳性细胞的应用，其特征在于：该中性粒细胞外捕获网阳性细胞可作为NETs检测试剂的阳性对照品。
...【技术特征摘要】
1.一种中性粒细胞外捕获网阳性细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种中性粒细胞外捕获网阳性细胞的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述刺激液的ph为7.2～7.4。
3.根据权利要求1所述的一种中性粒细胞外捕获网阳性细胞的制备方法，其特征在于，步骤s2中，血液与刺激液的体积比为(1～1.5)ml：(40～45)ml。
4.根据权利要求1所述的一种中性粒细胞外捕获网阳性细胞的制备方法，其特征在于，步骤s2中，孵育过程分多次进行。
5.根据权利要求1所述的一种中性粒细胞外捕获网阳性细胞的制备方法，其特征在于，步骤s2中的孵育过程为：
6.根据权利要求1所述的一种中性粒细胞外捕获网阳性细胞的制...
【专利技术属性】
技术研发人员：王渺得，杨志军，焦慧宇，王蕊，
申请(专利权)人：苏州奎克泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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