【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测技术，特别涉及一种基于hnb-lamp耦合crispr/cas12a的肠道病毒及其ev-a71的检测方法及试剂盒。 属于微生物检验。
技术介绍
1、肠道病毒属于小rna病毒科肠道病毒属，多种肠道病毒能引起人类疾病，包括手足口病(hmfd)，急性弛缓性瘫痪，急性出血性结膜炎、无菌性脑膜炎和心肌炎等。肠道病毒通过呼吸道和消化道传播，具有引发大规模疾病流行的潜在威胁。肠道病毒感染可发生于任何年龄，其中1岁以下婴儿感染率比儿童和成人高7倍。夏秋季是肠道病毒的主要流行期，在肠道病毒感染流行期间，新生儿感染率高达13%。且其易引发新生儿病房暴发流行。
2、国际病毒分类学委员会根据肠道病毒生物学及遗传特征将肠道病毒分为肠道病毒ａ组、ｂ组、ｃ组、ｄ组。其中，肠道病毒感染的重症及死亡病例多由enterovirus 71（ev-a71）所致。ev-a71是高度嗜神经病毒，可引起患者严重的中枢神经系统并发症，ev-a71感染已成为全球的一个重要公共卫生问题，是肠道病毒相关感染的重点监测对象。
3、对于肠道病毒感染的检测和鉴定，不仅需要确定是否是肠道病毒感染，还需要重点关注是否是ev-a71型。能够同时检测和区分 evs和 ev-a71的快速、敏感和可行的诊断检测方法的是evs监测的理想辅助工具，有助于在预测疫情可能严重程度方面做出疫情应对，极大地提高对该病的前期发现和治疗的及时性，从而启动适当的干预措施。
4、细胞培养病毒分离诊断是肠道病毒检测的常规方法，但是其耗时长，操作繁琐，远远不能满足快
5、环介导等温放大（lamp）技术是被认为是rt‐qpcr的潜在代替方案，lamp 对抑制剂的耐受性更强，使用的bst dna聚合酶在等温条件下即能完成免提取的核酸扩增。并且，lamp能很好的结合比色指示剂，例如羟基萘酚蓝 (hnb)存在下，lamp的阳性扩增变为天蓝色，阴性扩增变为紫罗兰色，利于对检测结果的床旁肉眼评估。近年来，尤其是随着crispr/cas分子诊断的发展，其与lamp的耦合（lamp-crispr/cas12）进一步增强的了检测的敏感度和特异性，有望成为poc诊断的理想方案。crispr/cas12在crispr rna（crrna）的引导下，可以识别大量的lamp扩增产物，并引发其对周围修饰报告荧光基团ssdna的反式切割，在产生可视的荧光信号。尽管如此，lamp-crispr/cas12的局限性在于一管仅能检测一种靶标，无法同时筛查肠道病毒及ev-a71亚型。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺点与不足，本专利技术提供了一种基于hnb-lamp耦合crispr/cas12a技术的肠道病毒及其ev-a71分型同时检测方法及试剂盒，可实现对肠道病毒及其ev-a71分型的快速检测，具有特异性好、灵敏度高和检测成本低等特点。
2、为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供的技术方案是：一种基于hnb-lamp耦合crispr/cas12a技术的肠道病毒及其ev-a71分型同时检测试剂盒 ，所述试剂盒包括：
3、两组lamp扩增引物。
4、5′-utr-f3 5′-acgggacgctagttgtga-3
5、5′-utr-b3 5′-attgtcaccataagcagcca-3′
6、5′-utr-fip
7、5′-attagccgcattcaggggccacagggtgtgaagagcctat-3′
8、5′-utr-bip
9、5′-tgtcgtaacgcgcaagtccggaaacacggacacccaaagt-3′
10、5′-utr-lf 5′-ggattcttatgtagcctc-3′
11、5′-utr-lb 5′-tggcggaaccgact-3′ 。
12、vp1-f3 5′-gcggagttcacttttgttgc-3
13、vp1-b3 5′-cgcaggtgacatgaatggta-3′
14、vp1-fip 5′-ggctccaggtggcacaaacatcacacc cacaggggaagt-3′
15、vp1-bip
16、5′-agccagattccagggaatccctagggt ctgacagcttgacaa-3′
17、vp1-lb 5′- gtattggagcaattgtgggaca-3′
18、vp1-lf 5′- catggcaaaccgccaccaa-3′
19、针对ev-a71 vp1序列设计 crrna：
20、vp1-crrna：
21、5′-aatttctactcttgtagattgccacctggagcccctaagcca-3′
22、ssdna 报告分子：fam-ttatt-bhq1
23、所述试剂盒还包括lamp试剂组分：1×warmstart lamp mixture，1.6μm内引物5′-utr-fip、 vp1-fip 和 5′-utr-bip、vp1-bip , 0.2μm 外引物5′-utr-f3、vp1-f3和5′-utr-b3、 vp1-b3,0.16μm 环引物5′-utr-lf、vp1-lf 和5′-utr-lb、vp1-lb ， 120μm hnb，crispr试剂组份： 2×rcutsmart缓冲液、100nm ascas12a、200nm crrna、1000nm dna报告分子。
24、所述检测方法，包括以下步骤：
25、步骤一：样本制备及配置检测体系，样本采集后，将样本放入释放保存液中；
26、步骤二：以待测样品中肠道病毒核酸样本为模板，在65℃下孵育40min，利用环介导等温放大（lamp）技术并采用特异性引物扩增目标片段，得到扩增产物；
27、步骤三：在自然光下依据比色法判断肠道病毒的检测结果，若为天蓝色则存在肠道病毒，若为紫罗兰色则不存在肠道病毒。
28、步骤四：将步骤一所得的扩增产物中与crispr/cas12a试剂混合，37℃恒温孵育10min，在crrna介导下进行特异性切割反应；
29、步骤五：对步骤三反应后的反应体系中使用蓝光激发，观察荧光显色情况，判断是否含有ev-a71，若为红色荧光则不存在ev-a71，若为绿色荧光则ev-a71。
30、有益效果：
31、本专利技术检测对象包括：普遍的肠道病毒（evs）和71型肠道病毒（ev-a71）。首先，基于肠道病毒5′-utr保守序列设计lamp引物进行本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于HNB-LAMP耦合CRISPR/Cas12a技术的肠道病毒及其EV-A71分型检测试剂盒，其特征在于：包括适用于肠道病毒及其71分型检测的HNB-CRISPR系统，所述HNB-CRISPR系统包括针对肠道病毒5′-UTR 保守序列设计LAMP引物组1、针对EV-A71 VP1序列设计LAMP引物组2、针对EV-A71 VP1序列设计 crRNA、ssDNA 报告分子；
2. 根据权利要求1所述的基于HNB-LAMP耦合CRISPR/Cas12a技术的肠道病毒及其EV-A71分型检测试剂盒，其特征在于：LAMP反应试剂组分包括如下：1×WarmStart LAMPmixture，1.6 μM内引物5′-UTR-FIP和5′-UTR-BIP如SEQ ID NO.3和如SEQ ID NO.4所示,0.2 μM 外引物5′-UTR-FIP F3和5′-UTR-FIP B3如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示,0.16μM 环引物5′-UTR- LF和5′-UTR-LB如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示， 1.6μM内引物VP1-
3.根据权利要求2所述的基于HNB-LAMP耦合CRISPR/Cas12a技术的肠道病毒及其EV-A71分型检测试剂盒，其特征在于：CRISPR反应试剂组分：100nM crRNA如SEQ ID NO.13所示、50nM AsCas12a蛋白、1×rCutSmart缓冲液，500nM DNA reporter。
4.根据权利要求1所述基于HNB-LAMP耦合CRISPR/Cas12a的肠道病毒及其EV-A71分型试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述基于HNB-LAMP耦合CRISPR/Cas12a的肠道病毒及其EV-A71分型试剂盒的使用方法，其特征在于：
...【技术特征摘要】
1.一种基于hnb-lamp耦合crispr/cas12a技术的肠道病毒及其ev-a71分型检测试剂盒，其特征在于：包括适用于肠道病毒及其71分型检测的hnb-crispr系统，所述hnb-crispr系统包括针对肠道病毒5′-utr 保守序列设计lamp引物组1、针对ev-a71 vp1序列设计lamp引物组2、针对ev-a71 vp1序列设计 crrna、ssdna 报告分子；
2. 根据权利要求1所述的基于hnb-lamp耦合crispr/cas12a技术的肠道病毒及其ev-a71分型检测试剂盒，其特征在于：lamp反应试剂组分包括如下：1×warmstart lampmixture，1.6 μm内引物5′-utr-fip和5′-utr-bip如seq id no.3和如seq id no.4所示,0.2 μm 外引物5′-utr-fip f3和5′-utr-fip b3如seq id no.1和seq id no.2所示,0.16μm 环引物5′-utr- lf和5′-utr-lb如seq id no.5和seq id no.6所示， 1.6...
【专利技术属性】
技术研发人员：季明辉，赵文武，杨沐怿，陈星彤，庄添驰，高畅，周子涵，李宁，刘云，孙涛，李为祖，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。