【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种大肠杆菌重组工程菌及其应用。
技术介绍
1、微生物天然产物一直是药物开发的重要来源，而且目前仍是新型天然产物的主要来源。其中，聚酮类化合物和非核糖体多肽类化合物是微生物产生的一类次级代谢产物，在自然界来源广泛，是天然产物的重要组成部分。这类化合物具有良好的药用价值和其他重要的生理功能，如抗肿瘤药阿奇霉素、抗菌药四环素、头孢菌素。传统天然产物的来源一般为陆生、海洋微生物，随着多年来对这些微生物的研究深入以及微生物天然产物基数的增加，新颖天然产物的发现愈发困难。如何更高效的发现新来源新结构天然产物成为微生物天然产物研究的一个关键问题。近年来，随着肠道微生物组学的快速发展，肠道微生物代谢小分子与机体的平衡和稳态密切相关。目前，关于肠道微生物的分离方法包括以下几种：1.梯度稀释平板涂布法：将微生物置于特定培养基中进行分离纯化，并通过倍比稀释和计数等方法计算微生物数量；2.基于微流控高通量的分离培养方法：通过微液滴中的单细胞培养单个微生物，并有效分离低丰度菌株。
2、鉴于梯度稀释平板法具有多样性、可操作性强、可扩展等优点，目前这一传统的分离培养方法仍广泛应用。但是传统稀释平板法，整体工作量大，费时费力，培养周期长，且无法培养厌氧菌。基于微流控的培养方法可以维持无氧或低水平氧含量的环境状态，可以用于厌氧微生物的培养，但基于微流控的培养过程中使用的极限稀释法对共生微生物的单个微生物培养十分不利且容易在稀释过程中丢失低丰度菌株。根据人类胃肠道统一基因组最新报道，超过70％肠道微生物物种未被培养(alm
3、随着高通量测序或下一代测序技术的发展，微生物研究开始采用扩增子测序和宏基因组测序，这些测序方法使得对微生物的研究可以绕开微生物的分离培养过程，从而提供一种对不可分离培养的微生物进行研究的途径。为此，专利技术人通过肠道微生物宏基因组dna文库构建及应用研究，从肠道微生物功能基因组的水平发掘肠道微生物产生的功能成分。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种大肠杆菌重组工程菌及其应用。
2、为实现专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：
3、本专利技术第一方面提供了一种大肠杆菌重组工程菌，所述大肠杆菌重组工程菌为大肠杆菌f10，拉丁文名为escherichia coli f10 ，保存于中国典型培养物保藏中心，地址为中国，武汉，保藏编号为cctcc no:m2024964，保藏日期为2024年5月16日。
4、本专利技术第二方面提供了一种上述第一方面所述大肠杆菌重组工程菌的构建方法。所述大肠杆菌f10的构建方法为：提取构建的fosmid文库中质粒的dna，以大肠杆菌e.colibl21作为宿主菌，将提取的fosmid文库质粒dna导入所述宿主菌中，采用平板扩散法挑选出有抑菌圈的菌落，经分离鉴定，得到具有抑菌活性的大肠杆菌f10。
5、根据上述的构建方法，优选地，所述fosmid文库为人肠道微生物fosmid文库。更加优选地，用于构建人肠道微生物fosmid文库的微生物样本来源为健康人粪便样品，利用健康人粪便样品根据copycontroltm fosmid library production kit(epicentre)操作说明构建fosmid文库。
6、根据上述的构建方法，优选地，所述fosmid文库的构建方法为：提取健康人粪便样品中的基因组dna；将所述基因组dna打断成片段，得到dna片段；所述dna片段经末端修复后进行电泳分离，回收特定大小的dna片段；将回收的特定大小dna片段与质粒连接后进行包装、筛选阳性克隆菌并保存得到fosmid文库。
7、本专利技术第三方面提供了上述第一方面所述大肠杆菌重组工程菌在合成吲哚类化合物中的应用。
8、根据上述的应用，优选地，所述吲哚类化合物为吲哚-3-甲醛(indole-3-carbaldehyde)或/和吲哚三聚体(trisindoline)，
9、所述吲哚三聚体的结构式如下：
10、
11、所述吲哚-3-甲醛的结构式如下：
12、
13、本专利技术第四方面提供了一种吲哚类化合物的制备方法，所述制备方法为：将上述第一方面所述大肠杆菌重组工程菌接种至发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液，发酵液经离心后收集上清，向所述上清中加入乙酸乙酯进行萃取，萃取结束收集上层液，对所述上层液进行浓缩，得到提取物浸膏；对所述提取物浸膏进行硅胶柱层析分离，收集硅胶柱层析的洗脱流分；所述洗脱流分经凝胶柱层析、高效液相色谱分离纯化，得到吲哚类化合物。
14、根据上述的制备方法，优选地，所述硅胶柱层析采用的层析柱为正向硅胶柱，所述硅胶柱层析采用的洗脱液为二氯甲烷和甲醇的混合液。更加优选地，所述吲哚类化合物为吲哚-3-甲醛时，硅胶柱层析采用的洗脱液由二氯甲烷和甲醇按体积比80:1混合而成；所述吲哚类化合物为吲哚三聚体时，硅胶柱层析采用的洗脱液由二氯甲烷和甲醇按体积比40:1混合而成。
15、根据上述的制备方法，优选地，所述凝胶柱层析采用的层析柱为sephadex lh-20凝胶柱，所述凝胶柱层析采用的洗脱液为二氯甲烷和甲醇的混合液。更加优选地，所述述凝胶柱层析采用的洗脱液由二氯甲烷和甲醇按体积比2:1混合而成。
16、根据上述的制备方法，优选地，所述高效液相色谱为半制备高效液相色谱；所述吲哚类化合物为吲哚-3-甲醛时，半制备高效液相色谱检测采用的色谱柱为ymc-pack ods柱，流动相为体积分数为55％的甲醇水溶液；所述吲哚类化合物为吲哚三聚体时，半制备高效液相色谱检测采用的色谱柱为ymc-pack ods柱，流动相为体积分数为50％的乙腈水溶液。
17、与现有技术相比，本专利技术取得的积极有益效果如下：
18、(1)本专利技术提供了一株新的大肠杆菌重组工程菌——大肠杆菌f10，大肠杆菌f10在发酵的过程中能够产生吲哚-3-甲醛和吲哚三聚体代谢产物，可以用于制备吲哚-3-甲醛和吲哚三聚体。
19、(2)本专利技术吲哚类化合物的制备方法是采用大肠杆菌重组工程菌——大肠杆菌f10作为发酵菌株进行发酵培养，并对发酵产物进行分离纯化得到吲哚类化合物，与现有的通过化学工艺制备方法相比，绿色环保，具有反应条件简单，副产物少，产物纯度高等优点，提供了一种新的制备吲哚-3-甲醛和吲哚三聚体的制备方法。
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1.一种大肠杆菌重组工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌重组工程菌为大肠杆菌F10，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2024964。
2.权利要求1所述大肠杆菌重组工程菌在制备吲哚类化合物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述吲哚类化合物为吲哚-3-甲醛或/和吲哚三聚体，所述吲哚三聚体的结构式如下：
4.一种吲哚类化合物的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述大肠杆菌重组工程菌接种至发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液，发酵液经离心后收集上清，向所述上清中加入乙酸乙酯进行萃取，萃取结束收集上层液，对所述上层液进行浓缩，得到提取物浸膏；对所述提取物浸膏进行硅胶柱层析分离，收集硅胶柱层析的洗脱流分；所述洗脱流分经凝胶柱层析、高效液相色谱分离纯化，得到吲哚类化合物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述硅胶柱层析采用的层析柱为正向硅胶柱，所述硅胶柱层析采用的洗脱液为二氯甲烷和甲醇的混合液。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述吲哚类化合物为吲哚-3-甲醛时
7.根据权利要求4-6任一所述的制备方法，其特征在于，所述凝胶柱层析采用的层析柱为Sephadex LH-20凝胶柱，所述凝胶柱层析采用的洗脱液为二氯甲烷和甲醇的混合液。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述凝胶柱层析采用的洗脱液中二氯甲烷和甲醇的体积比为2:1。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述高效液相色谱为半制备高效液相色谱；所述吲哚类化合物为吲哚-3-甲醛时，半制备高效液相色谱检测采用的色谱柱为YMC-Pack ODS柱，流动相为体积分数为55％的甲醇水溶液；
...【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌重组工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌重组工程菌为大肠杆菌f10，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m2024964。
2.权利要求1所述大肠杆菌重组工程菌在制备吲哚类化合物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述吲哚类化合物为吲哚-3-甲醛或/和吲哚三聚体，所述吲哚三聚体的结构式如下：
4.一种吲哚类化合物的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述大肠杆菌重组工程菌接种至发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液，发酵液经离心后收集上清，向所述上清中加入乙酸乙酯进行萃取，萃取结束收集上层液，对所述上层液进行浓缩，得到提取物浸膏；对所述提取物浸膏进行硅胶柱层析分离，收集硅胶柱层析的洗脱流分；所述洗脱流分经凝胶柱层析、高效液相色谱分离纯化，得到吲哚类化合物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述硅胶柱层析采用的层析柱为正向硅胶柱...
【专利技术属性】
技术研发人员：张梦雪，朱海华，王鋆坦，郭碧珊，尚慧毅，刘红伟，王法云，
申请(专利权)人：河南省商业科学研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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