【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及海洋生物蛋白肽领域，特别是一种高活性鱿鱼皮抗氧化肽及其制备方法。
技术介绍
1、抗氧化肽作为一种天然抗氧化剂因其分子量低、活性高、易于吸收、无副作用等优点，兼具营养性和降血压、提高免疫等功能性受到广泛关注。抗氧化肽因为符合“天然、安全、无毒、营养价值高”等特点在食品领域被广泛应用，已成为功能食品中使用率最高的天然产物之一。利用低成本生物资源开发具有营养性、安全性的抗氧化肽一直是多肽领域的研究热点。
2、鱿鱼，又名柔鱼、枪乌贼，属于软体动物门，头足纲，鞘亚纲，十腕总纲管，鱿目，开眼亚目，是一种重要的海洋经济动物和海洋食品。2020年，我国鱿鱼捕获量达到29.56万吨，产量也在不断增加，在鱿鱼加工中，会产生30％左右鱿鱼副产物，主要鱿鱼皮、鱿鱼墨汁、鱿鱼软骨、鱿鱼内脏等，目前大部分鱿鱼加工副产物没有得到有效利用或被丢弃，造成严重的资源浪费及环境污染。鱿鱼皮约占鱿鱼副产物总量的8％～13％，富含大量蛋白质，蛋白质约占鱿鱼皮干重的88％左右，其中胶原蛋白含量约占鱿鱼皮蛋白质的50％，是良好的潜在生物活性肽来源。
3、生物信息学工具辅助筛选活性肽，是基于活性肽中已知的氨基酸序列，利用数据库搜索和软件分析，对肽段可能的生物活性、安全性及生物可及性等性质进行预测，选取目标肽段化学合成并对其相关性质进行验证。通过生物信息学工具可节省大量时间成本和实验成本。keap1-nrf2通路可以通过调节超过600个相关的基因以维持细胞氧化还原平衡和代谢，是机体应对氧化应激的重要信号通路之一。近年来，同源性建模和分子对接
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的第一个技术问题是针对现有技术的现状，提供一种利用生物信息学方式筛选出的高活性鱿鱼源抗氧化肽。
2、本专利技术所要解决的第二个技术问题是针对现有技术的现状，提供一种上述高活性鱿鱼源抗氧化肽的制备方法。
3、本专利技术所要解决的第三个技术问题是针对现有技术的现状，提供一种上述高活性鱿鱼源抗氧化肽的筛选方法。
4、本专利技术所要解决的第四个技术问题是针对现有技术的现状而提供一种上述高活性鱿鱼源抗氧化肽的应用。
5、本专利技术解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：一种高活性鱿鱼皮抗氧化肽，该抗氧化肽的氨基酸序列gln-asp-gly-phe-gln-gly-ala-his或者ser-gly-asp-asn-leu-arg-phe-pro。
6、本专利技术解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为：一种上述鱿鱼皮抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：
7、(1)鱿鱼皮的前处理
8、取鱿鱼皮搅碎处理后用纱布吸干水分，得到鱿鱼皮碎末；
9、(2)高活性酶解产物的制备
10、将步骤(1)所得鱿鱼皮碎末用缓冲液配制为悬浊液，加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解完毕后收集上清液，得到酶解产物；
11、(3)高活性酶解产物的分离
12、对步骤(2)制备得到的酶解产物通过凝胶柱进行分离，对各分离级分的抗氧化活性进行测定，得到最高活性分离级分。
13、优选地，步骤(2)中所述的缓冲液的ph为8.0～10.0，并使用该缓冲液将步骤(1)所得鱿鱼皮碎末配制成料液比为1:1～7的悬浊液，加入按底物质量计为1500～3500u/g的碱性蛋白酶，然后在40～60℃下酶解1～5h得到酶解液，最后将酶解液在95～100℃的温度下保温15～25min，冷却后在8000～10000r/min的条件下离心并收集上清液，上清液经浓缩冻干即得酶解产物。
14、优选地，步骤(2)中所述的缓冲液的ph为10，并使用该缓冲液将步骤(1)所得鱿鱼皮碎末配制成料液比为1:4.5的悬浊液，加入按底物质量计为2625u/g的碱性蛋白酶，然后在40℃下酶解4.5h得到酶解液，最后将酶解液在100℃的温度下保温15min，冷却后在10000r/min的条件下离心并收集上清液，上清液经浓缩冻干即得酶解产物。
15、优选地，步骤(3)中所述凝胶柱为sephadex g-15凝胶层析柱，对所述酶解产物进行分离纯化的具体条件为：洗脱液为纯水，检测波长为220nm，上样量为100mg，流速为0.5ml/min。
16、本专利技术解决上述第三个技术问题所采用的技术方案为：一种高活性鱿鱼皮抗氧化肽的筛选方法，对上述的制备方法得到的最高活性分离级分进行筛选，所述筛选方法包括以下步骤：
17、(4)对所述最高活性分离级分进行序列鉴定，得到鱿鱼皮肽序列组；
18、(5)将步骤(4)鉴定出的鱿鱼皮肽序列组与keap1蛋白进行分子对接，筛选出活性高的鱿鱼皮肽序列。
19、优选地，步骤(4)中，所述序列鉴定的具体过程为：通过lc-ms/ms对最高活性分离级分进行测定，再采用denovo的方法进行序列解析。
20、优选地，步骤(5)中采用keap1蛋白kelch区域16mer nrf2结合的pdb文件2flu作为对接的受体文件，并进行预处理定义其活性中心坐标为x＝5，y＝9，z＝1，活性中心半径为9.5a。
21、优选地，步骤(5)中，鱿鱼皮肽序列组中的每一个序列均作为配体，所有配体结构由chem3d生成，利用charmm力场对其进行能量最小化处理。
22、优选地，步骤(5)中，将受体与配体进行cddock对接，筛选与keap1蛋白-cddockenergy值高的鱿鱼皮肽序列。
23、本专利技术解决上述第四个技术问题所采用的技术方案为：一种上述的鱿鱼皮抗氧化肽在制备食品添加剂或日化用品中的应用。
24、与现有技术相比，本专利技术的优点在于：
25、(1)本专利技术从鱿鱼皮中筛选的抗氧化肽的抗氧化活性良好且无细胞毒性；
26、(2)本专利技术经admet预测，该鱿鱼皮抗氧化肽无毒副作用，且具有肠道吸收能力，经peptide ranker预测，该鱿鱼皮抗氧化肽具有体内生物活性，且稳定性实验表明该鱿鱼皮抗氧化肽在酸、热环境中活性保持在70％以上，因而具有较好应用前景；
27、(3)本专利技术利用分子对接和数据库预测的模拟方式在343条肽序列中精准筛选到具有高抗氧化活性且无毒性的鱿鱼皮抗氧化肽序列，简化了筛选过程、极大地节约了实验成本；
28、(4)本专利技术所采用的原料为海洋经济鱼类鱿鱼的加工废弃物，有效避免了环境污染，提高了资源利用率。
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1.一种高活性鱿鱼皮抗氧化肽，其特征在于，该抗氧化肽的氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Phe-Gln-Gly-Ala-His或者Ser-Gly-Asp-Asn-Leu-Arg-Phe-Pro。
2.一种如权利要求1所述鱿鱼皮抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
3.根据权利2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的缓冲液的pH为8.0～10.0，并使用该缓冲液将步骤(1)所得鱿鱼皮碎末配制成料液比为1:1～7的悬浊液，加入按底物质量计为1500～3500U/g的碱性蛋白酶，然后在40～60℃下酶解1～5h得到酶解液，最后将酶解液在95～100℃的温度下保温15～25min，冷却后在8000～10000r/min的条件下离心并收集上清液，上清液经浓缩冻干即得酶解产物。
4.根据权利3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的缓冲液的pH为10，并使用该缓冲液将步骤(1)所得鱿鱼皮碎末配制成料液比为1:4.5的悬浊液，加入按底物质量计为2625U/g的碱性蛋白酶，然后在40℃下酶解4.5h得到酶解液，最后将酶解液在100℃的温度
5.根据权利2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述凝胶柱为Sephadex G-15凝胶层析柱，对所述酶解产物进行分离纯化的具体条件为：洗脱液为纯水，检测波长为220nm，上样量为100mg，流速为0.5mL/min。
6.一种高活性鱿鱼皮抗氧化肽的筛选方法，其特征在于，对权利要求2～5任意一项所述的制备方法得到的最高活性分离级分进行筛选，所述筛选方法包括以下步骤：
7.根据权利6所述的筛选方法，其特征在于，步骤(4)中，所述序列鉴定的具体过程为：通过LC-MS/MS对最高活性分离级分进行测定，再采用Denovo的方法进行序列解析。
8.根据权利6所述的筛选方法，其特征在于，步骤(5)中采用Keap1蛋白Kelch区域16merNrf2结合的PDB文件2FLU作为对接的受体文件，并进行预处理定义其活性中心坐标为X＝5，Y＝9，Z＝1，活性中心半径为9.5A；鱿鱼皮肽序列组中的每一个序列均作为配体，所有配体结构由Chem3D生成，利用CHARMm力场对其进行能量最小化处理。
9.根据权利8所述的筛选方法，其特征在于，步骤(5)中，将受体与配体进行CDDOCK对接，筛选与Keap1蛋白-CDDOCK Energy值高的鱿鱼皮肽序列。
10.一种如权利要求1所述的鱿鱼皮抗氧化肽在制备食品添加剂或日化用品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种高活性鱿鱼皮抗氧化肽，其特征在于，该抗氧化肽的氨基酸序列gln-asp-gly-phe-gln-gly-ala-his或者ser-gly-asp-asn-leu-arg-phe-pro。
2.一种如权利要求1所述鱿鱼皮抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
3.根据权利2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的缓冲液的ph为8.0～10.0，并使用该缓冲液将步骤(1)所得鱿鱼皮碎末配制成料液比为1:1～7的悬浊液，加入按底物质量计为1500～3500u/g的碱性蛋白酶，然后在40～60℃下酶解1～5h得到酶解液，最后将酶解液在95～100℃的温度下保温15～25min，冷却后在8000～10000r/min的条件下离心并收集上清液，上清液经浓缩冻干即得酶解产物。
4.根据权利3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的缓冲液的ph为10，并使用该缓冲液将步骤(1)所得鱿鱼皮碎末配制成料液比为1:4.5的悬浊液，加入按底物质量计为2625u/g的碱性蛋白酶，然后在40℃下酶解4.5h得到酶解液，最后将酶解液在100℃的温度下保温15min，冷却后在10000r/min的条件下离心并收集上清液，上清液经浓缩冻干即得酶解产物。
5.根据权利2所述的制备方法，其特征在于，...
【专利技术属性】
技术研发人员：戚向阳，陈峰，曹少谦，刘合生，盛宇琳，杨华，颜金鑫，阮帝，华正好，
申请(专利权)人：浙江万里学院，
类型：发明
国别省市：
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