【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域。具体而言，本专利技术涉及一种改造的klenow片段及应用。背景介绍klenow酶，也叫klenow片段或者klenow大片段，是大肠杆菌dna聚合酶i经过枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶处理后得到的两个片段中的分子量较大的那个片段。klenow片段保留了dna聚合酶i的5ˊ-3ˊ聚合酶和3ˊ-5ˊ外切酶活性、缺少5ˊ-3ˊ外切酶活性，常用于补平dna单链末端。另外，试验也常使用的exo-klenow片段，是klenow片段的突变体，为不具有外切酶活性的klenow片段，该酶也常表示为klenow片段(3'→5'exo-)。klenow片段或exo-klenow片段可在37摄氏度进行聚合反应/扩增，因而利用klenow片段或exo-klenow片段进行扩增反应对实验设备等的温控要求相对较低；并且，klenow片段或者exo-klenow片段相对于dna聚合酶i来说，分子量较小，合成相应的核酸序列来构建表达载体相对较容易，便于制备，利于工业应用。klenow片段或exo-klenow片段的扩增效果与该聚合酶本身的特性包括合成能力、保真度/校正能力、特异性/酶活性以及稳定性有关，也与反应环境包括反应条件有关，如测序缓冲液、核苷酸种类、固体介质表面结构(与酶的吸附作用)等。可能由于klenow片段不耐高温、聚合能力偏低或者说该酶整体表现出的性能相对弱，目前市场上的扩增平台包括测序平台等较少使用该酶，也较少对该酶进行改造。提升或者调整klenow片段的某一方面性能，利于增加其工业实用性。
技术介绍
技
1、专利技术人利用野生型klenow片段和市售的klenow片段试剂盒进行测试发现：野生型klenow片段或其常见突变体exo-klenow片段，在核酸序列扩增中尤其在测序反应中，不能获得较好的结果，如利用该些酶进行核苷酸延伸反应例如测序，获得的测序平均读长和有效数据量等测序指标均较不理想；而且，相较于市售的klenow片段，野生型klenow片段和exo-klenow片段在测序中表现出的性能相对更弱。
2、本专利技术旨在至少在一定程度上解决上述技术问题至少之一。
3、为此，本专利技术的第一方面提供了一种改造的klenow片段，该改造的klenow片段氨基酸序列上的f762、a842、i709和p603中的至少一个位置或者功能等效的位置包含至少一个氨基酸置换突变。这里，改造的klenow片段氨基酸序列上的氨基酸位置编号，以dna聚合酶i(uniprotkb登录号：p00582，https://www.uniprot.org/uniprot/p00582)为基准，如f762，表示该改造的klenow片段氨基酸序列上对应于dna聚合酶i的氨基酸序列的第762位的f(苯丙氨酸)存在突变。
4、在一些示例中，所称的氨基酸置换突变选自功能相当于f762y、a842k、a842h、a842r、i709k、i709h、i709r和p603k置换突变中的至少一种。在一些示例中，例如，该改造的klenow片段的错义突变为下列1)-14)中的任意一种：1)f762y；2)a842k；3)i709k；4)f762y和a842k；5)f762y、a842k和p603k；6)a842k和i709k；7)f762y和i709k；8)f762y、a842k和i709k；9)a842h和i709k；10)a842k和i709h；11)a842h和i709h；12)a842r和i709k；13)a842k和i709r；14)a842r和i709r。在另一些示例中，该改造的klenow片段为混合酶，例如为上述具有1)-14)中的两种或者两种以上的改造的klenow片段的混合物。
5、本专利技术这一方面提供的改造的klenow片段均具有较高的合成能力包括较快的合成速度和/或与底物较高的亲和力，应用于测序时，表现出与修饰的核苷酸和/或生长的dna链有较强的兼容性，利于获得更长的读长和/或提高高质量数据的占比。
6、关于突变的命名规则，本文采用本领域公认的人类基因组变异协会制定的规则(hgvs突变命名规则)，如p.trp26cys，表示以蛋白质为参考序列、第26位的trp被cys取代；如无特别说明，本文提及的突变均为氨基酸突变，参考序列为蛋白质，书面表示该些突变时，均省略“p.”。
7、可以理解地，相同功能的突变可以有多种不同的表示方式，例如，以不同类型的参考序列为基准，如以基因组dna和以蛋白质为参考序列，相同的突变具有不同的表示方式，再例如，以相同蛋白的一部分或者全部作为参考序列，突变的位置编号可能不同；依据具体参考序列信息，本领域人员能够知晓和识别出不同表示方式包括以不同位置编号表示的相同功能位置的相同突变，该些以不同表示方式表示与本专利技术该方面提供的相同突变的改造的klenow片段，均属于本专利技术该方面所称的改造的klenow片段。
8、为了直观显示专利技术人经过突变、测试、来回筛选验证后而提供的改造的klenow片段的性能，在一些示例中，将该(些)改造的klenow片段和商业化的klenow片段分别应用于测序，进行结果对比，所称的商业化的klenow酶包括neb公司的klenow片段(neb公司，货号m0407b)和vazyme公司的klenow片段(诺唯赞公司，货号n105-c1)；另外，通过试验测试该(些)改造的klenow片段的特性，并与野生型klenow片段的进行对比。
9、所称的野生型klenow片段同一般所说的野生型，相对于突变型，指自然群体中最常见的类型；在一些示例中，为利于制备在野生型氨基酸序列的末端引入一段不影响酶反应性能的已知序列的klenow片段，该带有一段已知序列的klenow片段，也称为野生型或带标签的野生型klenow片段；在一些示例中，为利于制备在改造的klenow片段氨基酸序列的末端引入一段不影响酶反应性能的已知序列的改造的klenow片段，该带有一段已知序列的改造的klenow片段，也称为改造的klenow片段或带标签的改造的klenow片段或带标签的突变型klenow片段。
10、所称的测序，指的是利用klenow片段的反应性能将带有可检测信号的核苷酸连接至核苷酸片段末端，并根据检测到的可检测信号种类确认连接的核苷酸或碱基的种类，所称的可检测信号包括荧光信号，如cy5，cy3等。
11、在下文涉及的酶的性能包括应用于测序获得的效果的描述中，如无例外说明，所称的brr(base repeat ratio)为重复碱基比例，表示被检测到连续发出信号或者连续发出一种信号的某个待检测位置对应的碱基数目占碱基总数的比例。出于正常序列包含多个连续重复碱基是少见的来定义该术语，例如，正常序列包含一段或多段包含5个或5个以上连续重复碱基，是很少见的，确定该定义的术语的数值大小能一定程度上反映测得的数据为客观/真实的可能性大小。测序一般包括多轮反应(cycle)以能测定出一段具有特定长度的序列(读段)，定义完成一次四种核苷酸的碱基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种改造的Klenow片段，其特征在于，所述改造的Klenow片段用于核酸测序，以DNA聚合酶I为基准，所述改造的Klenow片段氨基酸序列存在氨基酸置换突变，且所述氨基酸突变为A842K和I709K的置换突变。
2.根据权利要求1所述的改造的Klenow片段，其特征在于，所述改造的Klenow片段氨基酸序列的至少一个末端带有一段长度小于12aa的已知序列；
3.一种核酸分子，所述核酸分子编码如权利要求1或2所述的改造的Klenow片段。
4.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求3所述的核酸分子。
5.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求4所述的载体。
6.一种使核苷酸结合到DNA中的方法，其特征在于，包括(a)如权利要求1-2任一所述的改造的Klenow片段或者改造的Klenow片段的混合物、(b)DNA和(c)核苷酸溶液发生相互作用。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述(c)核苷酸溶液包含的核苷酸为带有荧光分子标记的核苷酸；
8.一种用于使核苷酸结合到DNA中的试剂盒，包括
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括核苷酸溶液；
10.权利要求8或9所述的任一试剂盒在核酸序列延伸反应的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种改造的klenow片段，其特征在于，所述改造的klenow片段用于核酸测序，以dna聚合酶i为基准，所述改造的klenow片段氨基酸序列存在氨基酸置换突变，且所述氨基酸突变为a842k和i709k的置换突变。
2.根据权利要求1所述的改造的klenow片段，其特征在于，所述改造的klenow片段氨基酸序列的至少一个末端带有一段长度小于12aa的已知序列；
3.一种核酸分子，所述核酸分子编码如权利要求1或2所述的改造的klenow片段。
4.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求3所述的核酸分子。
5.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求4...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈清斌，陈巍月，李红丹，林霞，王文，骆玮玮，孙雷，
申请(专利权)人：深圳市真迈生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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