【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物雄性不育材料创制技术，特别是甘蓝显性雄性不育基因ms-cd1、启动子序列、及其在植物育种中的应用。
技术介绍
1、雄性不育是许多作物物种中广泛用于杂种优势利用的最有效工具(kim和zhang，2018)。从遗传学角度来看，雄性不育包括两种类型：细胞质雄性不育(cms)和基因雄性不育(gms)。cms和热敏/光敏雄性不育(tgms/pgms)已成功应用于杂交育种。然而，这些技术存在一些内在的问题，比如细胞质雄性不育系表现出杂交种子质量和产量低、遗传多样性低以及疾病易感性增加的风险，并且tgms/pgms系统容易受到气候条件波动的影响，从而导致生产低纯度的不育系。显性基因雄性不育(dgms)被认为是后杂种优势利用时代高效利用杂种优势的有前途工具(wan et al.,2021)，但是由于缺乏dgms基因和利用雄性不育系的有效系统，dgms尚未广泛应用于提高作物产量。如何开发dgms基因的可用性和实用的雄性不育系统对于作物生产非常重要。
2、甘蓝(brassica oleracea l.var.capitata l.)是一种重要的十字花科芸薹属蔬菜作物，在世界各地广泛栽培。甘蓝杂种优势很强，生产中应用的优良品种大部分为一代杂种。目前甘蓝杂交制种主要依赖于细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility,cms)和显性基因雄性不育(dominant genic male sterility,dmgs)，其中后者的不育源来自79-399-3突变体，是国内外首次发现的甘蓝dgms突变体，但其
技术实现思路
1、专利技术人首次克隆并公布了ms-cd1启动子和基因序列，构建了ms-cd1启动子和基因序列的重组表达载体；在此基础上，利用基因编辑技术创制适用于多个物种杂种优势利用的显性雄性不育系统；还提供了一种创制纯合体显性雄性不育系ho-dgms的方法；本专利技术进一步利用酵母单杂交筛库方法筛选到一个上游调控基因boerf1l，并通过酵母单杂、凝胶迁移、双荧光素酶报告系统以及荧光定量qrt-pcr验证boerf1l是直接与ms-cd1pwt启动子中的gac-like顺式作用元件负调控ms-cd1的表达来调节花粉活力和育性。这一系列研发成果在推动显性核基因雄性不育(dmgs)在育种中的广泛应用奠定了重要基础，是本领域的重大突破。
2、本专利技术的第一方面，本专利技术请求保护调控植物雄性育性的ms-cd1基因及其启动子，及其上游调控基因boerf1l及其功能应用，具体如下：
3、1.一种调控植物雄性育性的显性雄性不育基因ms-cd1，其基因全长核苷酸序列如seq idno.3所示，其编码区序列如seq id no.4所示。
4、2.权利要求1所述的显性雄性不育基因ms-cd1的启动子，其核苷酸序列如seq idno.1或2所示，其中seq id no.1所示的核苷酸序列为可育性启动子，seq id no.2所示的核苷酸序列为突变的不育性启动子。
5、3.权利要求1所述的显性雄性不育基因ms-cd1的上游调控基因boerf1l，其核苷酸序列如seq id no.5所示。
6、4.一种人工制备的多核苷酸，用于改变植物材料的雄性育性，其具有以下任一特征：
7、特征(1)其具有seq id no.2所示的突变启动子核苷酸序列；
8、特征(2)其具有seq id no.3所示的ms-cd1基因全长核苷酸序列或seq id no.4所示的ms-cd1基因编码区核苷酸序列；
9、特征(3)其具有seq id no.2所示的突变启动子核苷酸序列，以及seq id no.3所示的ms-cd1基因全长核苷酸序列或seq id no.4所示的ms-cd1基因编码区核苷酸序列；
10、特征(4)其是基于rnai原理构建，具有针对boerf1l基因编码区的单链rna序列，用于敲除乙烯反应因子boerf1l基因或干扰乙烯反应因子boerf1l基因的表达；所述boerf1l基因是所述ms-cd1基因的上游调控基因，其编码区的核苷酸序列如seq id no.6所示；
11、特征(5)是基于rnai原理构建，具有针对ms-cd1基因编码区的单链rna序列，用于敲除ms-cd1基因；其编码区的核苷酸序列如seq id no.4所示。
12、5.根据权利要求4所述的多核苷酸，具有特征(4)的多核苷酸是crispr/cas9基因编辑载体，用于敲除乙烯反应因子boerf1l基因；具有特征(5)的多核苷酸是crispr/cas9基因编辑载体，用于敲除ms-cd1基因。
13、6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于：所述针对boerf1l基因编码区的单链rna序列为5’-attatgtacagctacgaggatgg-3’；所述针对ms-cd1基因编码区的单链rna序列5'-acgatgcatcgcacaagaaaggg-3'。
14、7.含有权利要求3～6任一所述的多核苷酸的生物材料，包括用于转化的农杆菌转化态细胞、培养液、植物细胞或愈伤组织中的一种或多种。
15、ii.本专利技术的第二方面，提供上述研发成果在创制育种材料中的应用。
16、8.一种创制植物显性雄性不育系的方法，其特征在于，包含以下任一途径：
17、途径(1)将如seq id no.2所示的ms-cd1启动子突变序列，seq id no.4所示的ms-cd1基因编码区序列构建至基因表达载体中，然后进行农杆菌介导的转化转入到目的植物材料中，筛选获得转基因株系；
18、途径(2)构建用于敲除编码乙烯反应因子的boerf1l基因的基因编辑载体，其具有针对boerf1l基因编码区的单链rna序列；然后进行农杆菌介导的转化将基因编辑载体转入到目的植物材料中，筛选鉴定获得boerf1l基因被敲除的株系，所述boerf1l基因编码区如seq id no.6所示；
19、途径(3)构建用于敲除ms-cd1基因的基因编辑载体，具有针对ms-cd1基因编码区的单链rna序列；然后进行农杆菌介导的转化将基因编辑载体转入到的目的植物材料中，筛选鉴定获得ms-cd1基因被敲除的株系，ms-cd1基因的核苷酸序列如seq id no.3所示，其编码区序列如seq id no.4所示；
20、途径(4)通过基因编辑方法使目标植物中ms-cd1基因的启动子序列如seq idno.2所示从而获得基因编辑株系。
21、9.根据权利要求8所述的方法，其中所述针对boerf1l基因编码区的单链rna序列为5’-attatgtacagctacgaggatgg-3’；所述针对ms-cd1基因编码区的单链rna序列5'-acgatgcatcgcacaagaaaggg-3'。
22、其中构建载体所用的引物序列如下：...
【技术保护点】
1.一种调控植物雄性育性的显性雄性不育基因Ms-cd1，其基因全长核苷酸序列如SeqID No.3所示，其编码区序列如Seq ID No.4所示。
2.权利要求1所述的显性雄性不育基因Ms-cd1的启动子，其核苷酸序列如Seq ID No.1或2所示，其中Seq ID No.1所示的核苷酸序列为可育性启动子，Seq ID No.2所示的核苷酸序列为突变的不育性启动子。
3.权利要求1所述的显性基因雄性不育Ms-cd1基因的上游调控基因BoERF1L，其核苷酸序列如Seq ID No.5所示。
4.一种人工制备的多核苷酸，用于调控植物材料的雄性育性，其具有以下任一特征：
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，具有特征(4)的多核苷酸是CRISPR/Cas9基因编辑载体，用于敲除乙烯反应因子BoERF1L基因；具有特征(5)的多核苷酸是CRISPR/Cas9基因编辑载体，用于敲除Ms-cd1基因。
6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于：所述针对BoERF1L基因编码区的单链RNA序列为5’-ATTATGTACAGCTAC
7.含有权利要求3～6任一所述的多核苷酸的生物材料，包括用于转化的农杆菌转化态细胞、培养液、植物细胞或愈伤组织中的一种或多种。
8.一种创制植物显性雄性不育系的方法，其特征在于，包含以下任一途径：
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述针对BoERF1L基因编码区的单链RNA序列为5’-ATTATGTACAGCTACGAGGATGG-3’；所述针对Ms-cd1基因编码区的单链RNA序列5'-ACGATGCATCGCACAAGAAAGGG-3'。
10.根据权利要求8所述的方法，所述植物包括单子叶和双子叶植物；所述单子叶植物包括水稻；所述双子叶植物包括甘蓝，番茄、油菜籽、烟草。
11.根据权利要求8所述的方法，所述途径(1)中，还包括对转基因成功的阳性材料进行与原始材料进行杂交构建群体，并统计群体的育性分离比来进行育性遗传规律分析。
12.一种创制植物显性基因雄性不育洗的方法，其特征在于，包含以下一个或多个方式：
...【技术特征摘要】
1.一种调控植物雄性育性的显性雄性不育基因ms-cd1，其基因全长核苷酸序列如seqid no.3所示，其编码区序列如seq id no.4所示。
2.权利要求1所述的显性雄性不育基因ms-cd1的启动子，其核苷酸序列如seq id no.1或2所示，其中seq id no.1所示的核苷酸序列为可育性启动子，seq id no.2所示的核苷酸序列为突变的不育性启动子。
3.权利要求1所述的显性基因雄性不育ms-cd1基因的上游调控基因boerf1l，其核苷酸序列如seq id no.5所示。
4.一种人工制备的多核苷酸，用于调控植物材料的雄性育性，其具有以下任一特征：
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，具有特征(4)的多核苷酸是crispr/cas9基因编辑载体，用于敲除乙烯反应因子boerf1l基因；具有特征(5)的多核苷酸是crispr/cas9基因编辑载体，用于敲除ms-cd1基因。
6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于：所述针对boerf1l基因编码区的单链rna序列为5’-attatgtacagctacgaggatgg...
【专利技术属性】
技术研发人员：吕红豪，韩风庆，方智远，张扬勇，袁凯文，孙文茹，杨丽梅，庄木，王勇，季家磊，刘玉梅，李占省，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：
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