【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于水产养殖，具体涉及一种金沙鲈鲤肾脏细胞系及其构建方法。
技术介绍
1、金沙鲈鲤(percocyprispingi)隶属于鲤形目鲤科鲈鲤属，是我国特有的珍贵野生鱼类，主要分布于四川、贵州、云南长江上游及其支流。金沙鲈鲤属于国家重点保护野生动物，保护级别为二级。为保护金沙鲈鲤种质资源，各研究团队相继开展了金沙鲈鲤的人工驯养、繁殖、病害防治等，但细胞层面的研究尚未见报道。
2、鱼类细胞培养相较于哺乳动物细胞培养，更易发生污染，导致失败率较高，这一定程度上加大了金沙鲈鲤细胞培养的难度。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种金沙鲈鲤肾脏细胞系的构建方法，克服了鱼类构建过程中易污染的问题，成功培养得到金沙鲈鲤肾脏细胞系。
2、本专利技术提供了一种金沙鲈鲤肾脏细胞系的构建方法，包括以下步骤：
3、将野生金沙鲈鲤进行人工暂养后，采集肾脏组织后消毒、细碎成组织块，经过原代培养和传代培养，得到金沙鲈鲤肾脏细胞系。
4、优选的，所述人工暂养时，养殖水体的温度为15～20℃，养殖水体的ph值为7.0～7.5，养殖水体的溶解氧为6.0～8.0mg/l，养殖水体的透明度70～90cm，养殖水体的高锰酸钾浓度为1～2mg/l；
5、所述人工暂养的时间为12～24h。
6、优选的，所述原代培养用原代培养基是以l-15培养基或dmem/f12培养基为基础培养基，还包含体积百分比浓度的15％～20％胎牛血清、20
7、所述原代培养基的ph值7.0～7.5，渗透压为260～300mosm/l。
8、优选的，所述传代培养时传代1～9代时，传代培养基是以l-15培养基或dmem/f12培养基为基础培养基，还包含体积百分比浓度的100～200iu/ml的青霉素、0.1～0.2mg/ml的链霉素、0.25～0.5μg/ml的两性霉素b和10～20μg/ml的庆大霉素；所述传代培养基的ph值为7.0～7.5，渗透压为260～300mosm/l；
9、当传代培养传至10代以后，用基础培养基培养细胞；所述基础培养基为含体积百分比浓度10％～20％的胎牛血清的l-15培养基或dmem/f12培养基；所述基础培养基的ph值7.0～7.5，渗透压为260～300mosm/l。
10、优选的，所述原代培养或传代培养的温度为15～20℃；
11、所述原代培养的天数为40～50天。
12、优选的，所述肾脏组织消毒用溶剂为pbs消毒液；所述pbs消毒液为含有100～300iu/ml的青霉素、0.1～0.3mg/ml的链霉素、0.25～0.75μg/ml的两性霉素b和10～30μg/ml的庆大霉素的pbs缓冲液。
13、优选的，所述肾脏原代细胞消化用酶液为含质量百分比浓度0.1％～0.2％的胰蛋白酶的0.1～0.3g/l edta溶液。
14、本专利技术提供了所述构建方法构建得到的金沙鲈鲤肾脏细胞系。
15、本专利技术提供了所述金沙鲈鲤肾脏细胞系的保存方法，将对数期的金沙鲈鲤肾脏细胞系经消化至单细胞后与细胞冻存液混合，冻存；
16、所述细胞冻存液是含58％～62％胎牛血清和8％～12％dmso的l-15培养基或dmem/f12培养基。
17、本专利技术提供了所述金沙鲈鲤肾脏细胞系的复苏方法，将冻存的金沙鲈鲤肾脏细胞系在28～32℃水浴条件下解冻，加入基础培养基后分离细胞，用基础培养液重悬培养；
18、所述基础培养基为含体积百分比浓度10％～20％的胎牛血清的l-15培养基或dmem/f12培养基；ph值7.0～7.5，渗透压为260～300mosm/l。
19、本专利技术提供了一种金沙鲈鲤肾脏细胞系的构建方法，包括以下步骤：将野生金沙鲈鲤进行人工暂养后，采集肾脏组织后消毒、细碎成组织块，经过原代培养和传代培养，得到金沙鲈鲤肾脏细胞系。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
20、1.本专利技术的构建方法操作简便易行，并且构建方法具有重复性，构建的细胞系可稳定传代；
21、2.与其它细胞系相比，用本专利技术的构建方法获得的肾脏细胞系原代培养中组织块污染率较低甚至不发生污染，大大提高了细胞系构建成功率；
22、3.本专利技术构建的金沙鲈鲤肾脏细胞系形态为成纤维样，能够连续传代并直接应用于生物学特性研究，满足了对金沙鲈鲤种质资源保存和理论研究及应用的需要；
23、4.细胞培养需要结合不同物种本身的生物学特点及其野外复杂的环境条件，并非独立事件，用本专利技术的构建方法获得了金沙鲈鲤首个细胞系，为野外来源濒危保护动物即时种质资源保存提供了很好的案例。
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1.一种金沙鲈鲤肾脏细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述人工暂养时，养殖水体的温度为15～20℃，养殖水体的pH值为7.0～7.5，养殖水体的溶解氧为6.0～8.0mg/L，养殖水体的透明度70～90cm，养殖水体的高锰酸钾浓度为1～2mg/L；
3.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述原代培养用原代培养基是以L-15培养基或DMEM/F12培养基为基础培养基，还包含体积百分比浓度的15％～20％胎牛血清、200～300IU/mL的青霉素、0.2～0.3mg/mL的链霉素、0.5～0.75μg/mL的两性霉素B和浓度为20～30μg/mL庆大霉素；
4.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述传代培养时传代1～9代时，传代培养基是以L-15培养基或DMEM/F12培养基为基础培养基，还包含体积百分比浓度的100～200IU/mL的青霉素、0.1～0.2mg/mL的链霉素、0.25～0.5μg/mL的两性霉素B和10～20μg/mL的庆大霉素；所述传代培养基的pH值为7.0～7
5.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述原代培养或传代培养的温度为15～20℃；
6.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述肾脏组织消毒用溶剂为PBS消毒液；所述PBS消毒液为含有100～300IU/mL的青霉素、0.1～0.3mg/mL的链霉素、0.25～0.75μg/mL的两性霉素B和10～30μg/mL的庆大霉素的PBS缓冲液。
7.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述肾脏原代细胞消化用酶液为含质量百分比浓度0.1％～0.2％的胰蛋白酶的0.1～0.3g/LEDTA溶液。
8.权利要求1～7中任意一项所述构建方法构建得到的金沙鲈鲤肾脏细胞系。
9.权利要求8所述金沙鲈鲤肾脏细胞系的保存方法，其特征在于，
10.权利要求8所述金沙鲈鲤肾脏细胞系的复苏方法，其特征在于，将冻存的金沙鲈鲤肾脏细胞系在28～32℃水浴条件下解冻，加入基础培养基后分离细胞，用基础培养液重悬培养；
...【技术特征摘要】
1.一种金沙鲈鲤肾脏细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述人工暂养时，养殖水体的温度为15～20℃，养殖水体的ph值为7.0～7.5，养殖水体的溶解氧为6.0～8.0mg/l，养殖水体的透明度70～90cm，养殖水体的高锰酸钾浓度为1～2mg/l；
3.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述原代培养用原代培养基是以l-15培养基或dmem/f12培养基为基础培养基，还包含体积百分比浓度的15％～20％胎牛血清、200～300iu/ml的青霉素、0.2～0.3mg/ml的链霉素、0.5～0.75μg/ml的两性霉素b和浓度为20～30μg/ml庆大霉素；
4.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述传代培养时传代1～9代时，传代培养基是以l-15培养基或dmem/f12培养基为基础培养基，还包含体积百分比浓度的100～200iu/ml的青霉素、0.1～0.2mg/ml的链霉素、0.25～0.5μg/ml的两性霉素b和10～20μg/ml的庆大霉素...
【专利技术属性】
技术研发人员：王晓爱，张源伟，高红玲，
申请(专利权)人：中国科学院昆明动物研究所，
类型：发明
国别省市：
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