【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学检测领域，具体地，涉及脑膜炎病原体的联检，更具体地，涉及草绿色链球菌、b族链球菌、脑膜炎奈瑟菌、按蚊伊丽莎白菌和李斯特菌的检测。
技术介绍
1、脑膜炎是一类脑膜弥漫性炎症性改变的疾病。脑膜就是覆盖脑的内衬，身体其他部位感染后发生，感染微生物可经血液移动到覆盖脑部，即可发生脑膜炎。草绿色链球菌、b族链球菌、脑膜炎奈瑟菌、按蚊伊丽莎白菌和李斯特菌是导致脑膜炎的病原体。
2、草绿色链球菌(svg)是一群异质性病原体的群体，是一种革兰氏阳性细菌，通常呈现为球状或链状排列，广泛存在于人体的口腔、呼吸道和消化道等黏膜表面，特别是口腔中的牙龈、舌背和颊黏膜等部位，能够帮助我们消化食物、抵御外来病原体的入侵，与其他微生物共同维护着口腔微生态平衡，同时，它也可以引起龋齿、鼓膜炎等口腔疾病，在免疫力低下的情况下，还可能引起心内膜炎、脑膜炎等严重感染。草绿色链球菌也可以从鼻窦炎、脑脓肿、肝脓肿、肺脓肿等分泌物标本中被分离出来，往往是混合菌群的一部分，常伴有厌氧菌混合感染。
3、b族链球菌(group b streptococcus，gbs)，又称无乳链球菌，是一种可定植在健康人体中的革兰阳性球菌。其为条件致病菌，健康成年人的胃肠道和(或)泌尿生殖道带菌率约为30％，孕妇阴道的带菌率为25％～40％。10％的新生儿可通过产道垂直传播获得gbs，其中约50％～70％被定植，1％～2％发展为侵袭性gbs感染，导致败血症和(或)细菌性脑膜炎。gbs为国外儿童细菌性脑膜炎常见病原菌之一，神经系统后遗症发生率高，预
4、脑膜炎奈瑟菌(nm)简称为脑膜炎球菌(meningococcus)，又名脑膜炎双球菌或脑脊髓膜炎双球菌，是一种革兰氏阴性菌，是流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)的病原菌。脑膜炎奈瑟菌，因其所导致的脑膜炎而闻名，亦会造成脑膜炎球菌血症(一种致命性的败血症)，只感染人类，并无寄生的动物，是唯一令细菌性感染脑膜炎成为流行病的病菌。约10％成人的鼻咽中有其踪迹。
5、按蚊伊丽莎白菌(elizabethkingia anophelis)是一种需氧、无动力、氧化酶阳性、吲哚阳性、非发酵革兰阴性杆菌，其广泛分布在各种自然环境中，包括水、土壤、沉积物、植物和动物的消化道内。按蚊伊丽莎白菌是一种相对新发现的病原体，新生儿、术后患者或患有基础疾病的老年人是其易感群体。常规鉴定方法或生化检测方法往往无法将它们与其他细菌区分开来，临床常错误地将按蚊伊丽莎白菌鉴定为脑膜败血伊丽莎白菌。
6、李斯特菌(listeria monocytogenes，lm)是一类兼性细胞内生长的革兰阳性细菌，也是一种嗜冷菌，属于人畜共患病类致病菌，病死率较高。lm致成人感染主要引起脑膜炎和败血症。lm致新生儿患病有早发型和晚发型，早发型为宫内感染，常导致胎儿败血症，晚发型在出生后2-3天引起脑膜炎、脑膜脑炎和败血症。
7、在致病菌种鉴定方面，目前真菌分类、分子分型和鉴定上都有多基因序列分析的应用，β-tubulin蛋白基因序列结合its(internaltranscribedspacer)间区序列分析可协助鉴定菌种属。qpcr(real-timequantitativepcr)实时荧光定量核酸扩增检测系统通过分析核糖体dna的its2间区可迅速准确检测福尔马林固定石蜡包埋组织中的病原真菌，并鉴定至种属水平。细菌培养所需时间长，导致难以早期诊断。
8、因此，本领域需求一种产品能够简单、快速地检测上述病原体，以便针对性的提供治疗策略，并且灵敏度高，特异性好。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术，第一方面，提供一种快速检测脑膜炎病原体的组合物，包括检测草绿色链球菌、b族链球菌、脑膜炎奈瑟菌、按蚊伊丽莎白菌和李斯特菌中至少3种病原体的引物对和探针：
2、如seq id no:1～3所示的检测草绿色链球菌的引物对和探针；
3、如seq id no:4～6所示的检测b族链球菌的引物对和探针；
4、如seq id no:7～9所示的检测脑膜炎奈瑟菌的引物对和探针；
5、如seq id no:10～12所示的检测按蚊伊丽莎白菌的引物对和探针；以及
6、如seq id no:13～15所示的检测李斯特菌的引物对和探针。
7、本专利技术使用实时荧光定量pcr技术，以特异针对草绿色链球菌、b族链球菌、脑膜炎奈瑟菌、按蚊伊丽莎白菌和李斯特菌的taqman荧光探针为基础，每扩增一条dna链，产生一个荧光分子，使得荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步，从而实现对草绿色链球菌、b族链球菌、脑膜炎奈瑟菌、按蚊伊丽莎白菌和李斯特菌特异识别。这不仅可以提高草绿色链球菌、b族链球菌、脑膜炎奈瑟菌、按蚊伊丽莎白菌和李斯特菌早期诊断率，还对精准用药提供了一定的指导。
8、荧光定量pcr(聚合酶链式反应)，在该反应体系中，包含一对特异性引物以及一个taqman探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；如反应体系存在靶序列，pcr反应时探针与模板结合，dna聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针酶切降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。荧光定量pcr仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(ct值)与病原体核酸浓度有关，病原体核酸浓度越高，ct值越小。最终可根据ct值来判断是否感染。
9、进一步地，所述组合物还包括如seq id no:16～18所示的管家基因rnasep的引物对和探针。
10、在一些实施方案中，本专利技术的组合物可以同时包括上述引物对和探针组成的一组或多组。在本文中，“组”是指检测一个靶点的互相匹配的上游引物、下游引物和探针。
11、进一步地，本专利技术的组合物可以任意组合成检测相应靶点的任意组合形式。本领域技术人员可以根据需要进行组合，检测哪几个靶点，即把对应靶点的引物和探针组进行组合即可。这些组合形式均包括在本专利技术中。
12、在一些具体的实施方案中，本专利技术组合物用于荧光pcr。
13、在一些具体的实施方案中，本专利技术组合物中的探针在5’端标记有荧光报告基团。
14、进一步地，如seq id no:3所示的检测草绿色链球菌的探针的荧光报告基团为fam；如seq id no:6所示的检测b族链球菌的探针的荧光报告基团为hex或vic；如seq idno:9所示的检测脑膜炎奈瑟菌的探针的荧光报告基团为rox。
15、进一步地，如seq id no:12所示的检测按蚊伊丽莎白菌的探针的荧光报告基团为cy5；如seq id no:15所示的检测李斯特菌的探针的荧光报告基团为quasar 705；如seq idno:18所示的检测管家基因rnasep的探针的荧光报告基团为atto 425。
16、在一些具体的实施方案中，探针的3’末端还具有荧光淬灭基团，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种快速检测脑膜炎病原体的组合物，其特征在于，包括检测草绿色链球菌、B族链球菌、脑膜炎奈瑟菌、按蚊伊丽莎白菌和李斯特菌中至少3种病原体的引物对和探针：
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，如SEQ ID NO:3所示的检测草绿色链球菌的探针的荧光报告基团为FAM；如SEQ ID NO:6所示的检测B族链球菌的探针的荧光报告基团为HEX或VIC；如SEQ ID NO:9所示的检测脑膜炎奈瑟菌的探针的荧光报告基团为ROX。
3.根据权利要求1中任一项所述的组合物，其特征在于，如SEQ ID NO:12所示的检测按蚊伊丽莎白菌的探针的荧光报告基团为CY5；如SEQ ID NO:15所示的检测李斯特菌的探针的荧光报告基团为QUASAR 705。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括如SEQID NO:16～18所示的管家基因RnaseP的引物对和探针。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，如SEQ ID NO:18所示的检测管家基因RnaseP的探针的荧光报告基团为ATTO 425。<...
【技术特征摘要】
1.一种快速检测脑膜炎病原体的组合物，其特征在于，包括检测草绿色链球菌、b族链球菌、脑膜炎奈瑟菌、按蚊伊丽莎白菌和李斯特菌中至少3种病原体的引物对和探针：
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，如seq id no:3所示的检测草绿色链球菌的探针的荧光报告基团为fam；如seq id no:6所示的检测b族链球菌的探针的荧光报告基团为hex或vic；如seq id no:9所示的检测脑膜炎奈瑟菌的探针的荧光报告基团为rox。
3.根据权利要求1中任一项所述的组合物，其特征在于，如seq id no:12所示的检测按蚊伊丽莎白菌的探针的荧光报告基团为cy5；如seq id no:15所示的检测李斯特菌的探针的荧光报告基团为quasar 705。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括如seqid no:16～18所示的管家基因rnasep的引物对和探针。...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓东，肖紫璇，程星，谭德勇，吴康，戴立忠，
申请(专利权)人：圣湘生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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